本發(fā)明涉及一種4-羥基異亮氨酸酶及其編碼基因與應(yīng)用，屬于生物。
背景技術(shù)：
1、(2s,3r,4s)-4-羥基異亮氨酸(4-hil)是一種來源于葫蘆巴種子里的一種羥基氨基酸，它具有以葡萄糖依賴方式刺激葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素的分泌，從而成為一種非常有前景的治療ⅱ型糖尿病的藥物。同時現(xiàn)有的臨床數(shù)據(jù)也表明它能有效降低人體總膽固醇水平，在體外和臨床前研究中，4-hil降低了葡萄糖水平，肝葡萄糖生成，葡萄糖/胰島素比率，肝損傷指標(biāo)，甘油三酸酯和總膽固醇，并增加了葡萄糖的利用率和高密度脂蛋白膽固醇的水平，具有抗肥胖的功效。肥胖在醫(yī)學(xué)角度來說是一種疾病，因為肥胖會帶來許多并發(fā)癥，例如高血壓，糖尿病等，通過研究治療肥胖和發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生肥胖的機理有助于更好的發(fā)現(xiàn)治療手段，從而幫助病人。因此4-hil在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。
2、在現(xiàn)階段研究中，獲取(2s,3r,4s)-4-羥基異亮氨酸的方法途徑主要有以下幾種：一是化學(xué)合成法；二是原材料提取法；三是生物合成法。然而傳統(tǒng)的化學(xué)合成法存在成本較高、環(huán)境污染、副產(chǎn)物含量多的缺點，并且單純通過化學(xué)法生成的4-羥基異亮氨酸構(gòu)型較多，導(dǎo)致工業(yè)合成的(2s,3r,4s)-4-羥基異亮氨酸的提取率很低。原材料提取法有步驟繁瑣、可持續(xù)性差的劣勢。生物合成法則具有成本低，可持續(xù)性強，反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好等特點，因此，生物酶法催化合成(2s,3r,4s)-4-羥基異亮氨酸成為目前研究的熱點。
3、4-羥基異亮氨酸羥化酶(ido)屬于fe(ⅱ)/α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶家族，它可以特異性催化l-異亮氨酸(ile)生成(2s,3r,4s)-4-羥基異亮氨酸，然而目前已發(fā)現(xiàn)的ido存在催化效率低，底物適配性差等瓶頸問題，因此，通過基因挖掘新酶基因或利用分子改造等方法獲得新型ido酶對高效合成(2s,3r,4s)-4-羥基異亮氨酸具有重要意義。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種4-羥基異亮氨酸酶及其編碼基因與應(yīng)用。
2、本發(fā)明技術(shù)方案如下：
3、一種4-羥基異亮氨酸酶hoido，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
4、上述4-羥基異亮氨酸酶hoido的編碼基因，其核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
5、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述4-羥基異亮氨酸酶hoido來自于鞘氨醇單胞菌(haliangiumochraceum)，可通過異源表達(dá)的方法制備得到。
6、一種重組表達(dá)載體，是在質(zhì)粒載體中插入上述4-羥基異亮氨酸酶hoido的編碼基因。
7、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述質(zhì)粒載體為pqe-80l。
8、一種重組菌株，是將上述重組載體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞中獲得。
9、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
10、上述4-羥基異亮氨酸酶hoido和/或4-羥基異亮氨酸酶hoido的編碼基因在制備(2s,3r,4s)-4-羥基異亮氨酸中的應(yīng)用。
11、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述應(yīng)用是以異亮氨酸為底物，利用4-羥基異亮氨酸酶hoido制備(2s,3r,4s)-4-羥基異亮氨酸，具體方法如下：
12、將異亮氨酸、feso4·7h2o、α-酮戊二酸(α-kg)、抗壞血酸和4-羥基異亮氨酸酶hoido酶液加入至hepes緩沖液中，構(gòu)建反應(yīng)體系；然后將反應(yīng)體系在30～45℃、100～150rpm下催化反應(yīng)0.5～1.5h，得到(2s,3r,4s)-4-羥基異亮氨酸(4-hil)；
13、所述反應(yīng)體系中異亮氨酸終濃度為5mmol/l、feso4·7h2o終濃度為0.15mmol/l、α-酮戊二酸終濃度為2mmol/l、抗壞血酸終濃度為2mmol/l、4-羥基異亮氨酸酶hoido酶液終濃度為1mg/l。
14、有益效果：
15、1、本發(fā)明提供的4-羥基異亮氨酸酶hoido易于異源表達(dá)與純化，可以高效、特異性地催化l-異亮氨酸生成(2s,3r,4s)-4-羥基異亮氨酸。
16、2、本發(fā)明提供的4-羥基異亮氨酸酶hoido相較于現(xiàn)有的4-羥基異亮氨酸酶，催化效率明顯提高，在合成生產(chǎn)4-羥基異亮氨酸過程中，可以有效的減少酶的用量，降低酶的使用成本。
17、3、本發(fā)明提供的4-羥基異亮氨酸酶hoido的生產(chǎn)和使用條件簡單溫和，在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)4-羥基異亮氨酸中有巨大的應(yīng)用潛力。
1.一種4-羥基異亮氨酸酶hoido，其特征在于，氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
2.權(quán)利要求1所述4-羥基異亮氨酸酶hoido的編碼基因，其特征在于，核苷酸序列如seqid?no.2所示。
3.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體是在質(zhì)粒載體中插入權(quán)利要求2所述4-羥基異亮氨酸酶hoido的編碼基因。
4.如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述質(zhì)粒載體為pqe-80l。
5.一種重組菌株，其特征在于，所述重組菌株是將權(quán)利要求4所述重組載體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞中獲得。
6.如權(quán)利要求5所述的重組菌株，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
7.權(quán)利要求1所述4-羥基異亮氨酸酶hoido和/或權(quán)利要求2所述4-羥基異亮氨酸酶hoido的編碼基因在制備(2s,3r,4s)-4-羥基異亮氨酸中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是以異亮氨酸為底物，利用4-羥基異亮氨酸酶hoido制備(2s,3r,4s)-4-羥基異亮氨酸，具體方法如下：