技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域，尤其涉及了一種用于治療結(jié)腸癌及預(yù)防轉(zhuǎn)移的中藥制劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤之一，在歐美發(fā)達(dá)國家，其發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤的第三位。在我國，結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率已由80年代的第五位和第六位上升至現(xiàn)今的第四位和第五位，每年約有20萬人死于結(jié)腸癌。這就意味著目前的治療仍不能將腫瘤細(xì)胞徹底根除。此外，結(jié)腸癌對標(biāo)準(zhǔn)治療的逐漸耐藥性促使人們越來越重視中醫(yī)中藥治療，且中醫(yī)中藥在治療結(jié)腸癌及預(yù)防轉(zhuǎn)移的過程中已顯示出一定的優(yōu)勢。中醫(yī)治療結(jié)腸癌的手段包括內(nèi)治外治、復(fù)方單方、針灸等。在多年腫瘤臨床工作中發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)中藥結(jié)合西醫(yī)手術(shù)及放化療等常規(guī)療法，效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于單純的西醫(yī)治療。此外，由于人們對西藥的副作用一直存有恐懼感，向往“回歸自然”。因此，開發(fā)有效的中藥制劑治療結(jié)腸癌及預(yù)防轉(zhuǎn)移具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種安全高效、并在治療結(jié)腸癌及預(yù)防轉(zhuǎn)移有明顯效果、且能明顯改善生活質(zhì)量和延長生存期的純中藥制劑，又名中藥復(fù)方“解毒三根湯制劑”。為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

它是由以下重量份數(shù)的原料構(gòu)成：藤梨根20-40份；虎杖根20-40份；水楊梅根20-40份。

在采用以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以采用以下技術(shù)方案：

優(yōu)選地，所述原料的重量份數(shù)為：

藤梨根25-35份；虎杖根25-35份；水楊梅根25-35份。

更優(yōu)選地，所述原料的重量份數(shù)為：

藤梨根26-30份；虎杖根26-30份；水楊梅根26-30份。

所述原料的重量配比最優(yōu)為藤梨根：虎杖根：水楊梅根=1:1:1。

藤梨根為獼猴桃科植物獼猴桃的根，具有清熱解毒，清熱利濕，祛風(fēng)除濕，防腫瘤抗癌，利尿止血，解毒消腫，利尿止血的功效，主治消化不良、嘔吐、風(fēng)濕痹痛、風(fēng)濕骨痛、消化道癌腫、消化道腫瘤、癰瘍瘡癤、跌打損傷、乳汁不下以及肝炎、水腫、跌打損傷，外傷出血、以及黃疸等病癥。一般用來治療腹部腫瘤的清熱解毒藥，尤其對于腸胃道方面的癌癥應(yīng)用更多，具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫和抑制體液免疫的作用，其抗腫瘤作用可能部分與其促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增強(qiáng)NK細(xì)胞活性有關(guān)。

虎杖根為蓼科植物虎杖的干燥根莖和根。春、秋二季采挖，除去須根，洗凈，趁鮮切短段或厚片，曬干。具有祛風(fēng)利濕，散瘀定痛，止咳化痰之功。用于治療關(guān)節(jié)痹痛、濕熱黃疸、經(jīng)閉、癓瘕、咳嗽痰多、水火燙傷、跌撲損傷、癰腫瘡毒等病癥?；⒄雀鶅?nèi)含有的蒽醌類化合物能抑制人早幼粒白細(xì)胞(HL-60)細(xì)胞活性。口服虎杖煎劑10天，對小鼠艾氏腹水癌的抑瘤率為35.3%，并能延長動(dòng)物存活時(shí)間。大黃素對小鼠肉瘤、小鼠肝瘤、小鼠乳腺癌、小鼠艾氏腹水癌、小鼠淋巴肉瘤、小鼠黑色素瘤及大白鼠瓦克癌等7個(gè)瘤株的抑制率均在30%以上。

水楊梅根為茜草科植物水楊梅的根。具有清熱解表；活血解毒的作用。水楊梅根醇浸膏每日以5g/kg連續(xù)灌胃或腹腔注身6d，對小鼠L615白血病有抑制作用，抑制率為21.4%。對宮頸癌細(xì)胞、AK肉瘤、W256也有抑制作用。

此外，本發(fā)明還提供了用于治療結(jié)腸癌及預(yù)防轉(zhuǎn)移的中藥制劑的顆粒產(chǎn)品的制備方法，包括以下步驟：

1）將藤梨根、虎杖根、水楊梅根按1:1:1比例混合，每100kg混合后的原料中加入1000L水，浸泡20-40min后，用大火煮沸后改用小火繼續(xù)煎煮，小火煎20-40min后，獲得藥液，將藥液過濾，濃縮至含生藥約1.2g/ml，得清膏；

2）將步驟1）中制得的清膏的半份通過干燥機(jī)噴霧制粉，干燥機(jī)的進(jìn)風(fēng)溫度160-180℃，出風(fēng)溫度80-100℃，得浸膏粉；余下的另一半清膏與浸膏粉進(jìn)一步通過制粒機(jī)制粒，制粒機(jī)進(jìn)風(fēng)溫度60-80℃，出風(fēng)溫度45-70℃，制得顆粒產(chǎn)品。

本發(fā)明還提供了用于治療結(jié)腸癌及預(yù)防轉(zhuǎn)移的中藥制劑的片劑產(chǎn)品的制備方法，包括以下步驟：

1）將藤梨根、虎杖根、水楊梅根按1:1:1比例混合，每100kg混合后的原料中加入1000L水，浸泡20-40min后，用大火煮沸后改用小火繼續(xù)煎煮，小火煎20-40min，獲得藥液，將藥液過濾，濃縮至含生藥約1.2g/ml，得清膏；

2）將步驟1）中制得的清高取半份通過干燥機(jī)噴霧制粉，干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)風(fēng)溫度160-180℃，出風(fēng)溫度80-100℃，得浸膏粉；余下的另一半清膏與浸膏粉進(jìn)一步通過制粒機(jī)制粒，進(jìn)風(fēng)溫度60-80℃，出風(fēng)溫度45-70℃，制得顆粒產(chǎn)品；將制得的顆粒產(chǎn)品進(jìn)行壓片，規(guī)格0.48-0.52g/片，用高效包衣機(jī)包衣制得片劑產(chǎn)品。

本發(fā)明又提供了用于治療結(jié)腸癌及預(yù)防轉(zhuǎn)移的中藥制劑的口服劑產(chǎn)品的制備方法，包括以下步驟：

1）將藤梨根、虎杖根、水楊梅根按1:1:1比例混合，每100kg混合后的原料中加入1000L水，浸泡20-40min后，用大火煮沸后改用小火繼續(xù)煎煮，小火煎20-40min，獲得藥液，將藥液過濾，采用三效節(jié)能濃縮器濃縮至含生藥約1.2g/ml，冷卻至室溫，加入適當(dāng)常規(guī)輔料，用水配成口服劑。

其中，常規(guī)輔料可為在中藥口服劑中用于改善口感的輔料，例如蔗糖、蜂蜜等。

由于采用了本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明產(chǎn)品為純中藥制劑，藤梨根20-40份；虎杖根20-40份；水楊梅根20-40份；并可將藤梨根、虎杖根、水楊梅根按1:1:1比例混合制成顆?；蚱瑒┗蚩诜┑犬a(chǎn)品，對于治療結(jié)腸癌及預(yù)防轉(zhuǎn)移具有明顯效果，并且能明顯緩解患者疼痛癥狀，改善生活質(zhì)量，延長生存期，藥物本身安全可靠高效，無副作用。

附圖說明

圖1為ELISA法結(jié)果顯示的解毒三根湯含藥血清組對CAFs作用24小時(shí)的表達(dá)情況。

圖2為ELISA法結(jié)果顯示的解毒三根湯含藥血清組對CAFs作用48小時(shí)的表達(dá)情況。

圖3為酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)模型組、中藥組、正常對照組中的24小時(shí)及48小時(shí)的CAFsI上清液中L-6表達(dá)情況。

圖4為酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)模型組、中藥組、正常對照組24小時(shí)的CAFs上清液中VEGF表達(dá)情況。

圖5為酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)模型組、中藥組、正常對照組48小時(shí)的CAFs上清液中VEGF表達(dá)情況。

圖6為酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)模型組、中藥組、正常對照組24小時(shí)及48小時(shí)的CAFs上清液中VEGF表達(dá)情況。

圖7為實(shí)時(shí)熒光定量PCR法顯示的模型組、中藥組、正常對照組對Caspase-8mRNA表達(dá)情況。

圖8為實(shí)時(shí)熒光定量PCR法顯示的模型組、中藥組、正常對照組對Caspase-3mRNA表達(dá)情況。

圖9為Transwell觀察的模型血清組的結(jié)腸癌CT-26透膜細(xì)胞示意圖。

圖10為Transwell觀察的正常血清對照組的結(jié)腸癌CT-26透膜細(xì)胞示意圖。

圖11為Transwell觀察的解毒三根湯血清組的結(jié)腸癌CT-26透膜細(xì)胞示意圖。

圖12為Transwell觀察的模型組、解毒三根湯血清組、正常對照組對結(jié)腸癌CT-26透膜細(xì)胞數(shù)量的影響。

圖13為24小時(shí)CAFs上清液中TGF-β1標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖14為48小時(shí)CAFs上清液中TGF-β1標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖15為24小時(shí)CAFs上清液中TGF-β1表達(dá)情況。

圖16為48小時(shí)CAFs上清液中TGF-β1表達(dá)情況。

圖17為24小時(shí)MMP-9標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖18為48小時(shí)MMP-9標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖19為24小時(shí)CAFs上清液中MMP-9表達(dá)情況。

圖20為48小時(shí)CAFs上清液中MMP-9表達(dá)情況。

圖21為α-SMA基因相對表達(dá)量結(jié)果。

圖22為TGF-β1基因相對表達(dá)量結(jié)果。

圖23為5天組作用24、48、72H后對細(xì)胞OD值的比較圖。

圖24為7天組作用24、48、72H后對細(xì)胞OD值的比較圖。

圖25為10天組作用24、48、72H后對細(xì)胞OD值的比較圖。

圖26顯示的是各組小鼠自造模成功之日起至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重變化曲線（x±S）(單位：g)。

圖27為單純中藥組、模型對照組、提前干預(yù)組、延后干預(yù)組、單純化療組的小鼠治療前后的去瘤體重變化。

圖28為單純中藥組、模型對照組、提前干預(yù)組、延后干預(yù)組、單純化療組的小鼠于造模過程中的瘤體體積變化（x±S）(單位：mm3)。

圖29為單純中藥組、提前干預(yù)組、延后干預(yù)組、單純化療組小鼠體積抑瘤率和質(zhì)量抑瘤率表示圖。

圖30為單純中藥組、模型對照組、提前干預(yù)組、維持干預(yù)組、延后干預(yù)組、單純化療組小鼠血清CEA、sCD44水平。

圖31為單純中藥組、模型對照組、提前干預(yù)組、維持干預(yù)組、延后干預(yù)組、單純化療組小鼠的生存曲線圖，單位：天。

圖32為單純中藥組、模型對照組、提前干預(yù)組、延后干預(yù)組、單純化療組的小鼠的移植瘤免疫組化的比較。

圖33中為各組小鼠瘤體蛋白Westernblot結(jié)果，分組從左到右依次為提前干預(yù)組、延后干預(yù)組、單純化療組、單純中藥組、模型對照組。

圖34為單純中藥組、模型對照組、提前干預(yù)組、延后干預(yù)組、單純化療組的小鼠移植瘤內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)情況(IOD)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明所述的用于治療結(jié)腸癌及預(yù)防轉(zhuǎn)移的中藥制劑是由以下重量份數(shù)的原料構(gòu)成：藤梨根20-40份；虎杖根20-40份；水楊梅根20-40份。

優(yōu)選地，所述原料的重量份數(shù)為：

藤梨根25-35份；虎杖根25-35份；水楊梅根25-35份。

更優(yōu)選地，所述原料的重量份數(shù)為：

藤梨根26-30份；虎杖根26-30份；水楊梅根26-30份。

所述原料的重量配比最優(yōu)為藤梨根：虎杖根：水楊梅根=1:1:1。

此外，本發(fā)明還提供用于治療結(jié)腸癌及預(yù)防轉(zhuǎn)移的中藥制劑的顆粒產(chǎn)品的制備方法，包括以下步驟：

1）將藤梨根、虎杖根、水楊梅根按1:1:1比例混合，每100kg混合后的原料中加入1000L水，浸泡20-40min后，用大火煮沸后改用小火繼續(xù)煎煮，小火煎20-40min后，獲得藥液，將藥液過濾，濃縮至含生藥約1.2g/ml，得清膏；

2）將步驟1）中制得的清膏的半份通過干燥機(jī)噴霧制粉，干燥機(jī)的進(jìn)風(fēng)溫度160-180℃，出風(fēng)溫度80-100℃，得浸膏粉；余下的另一半清膏與浸膏粉進(jìn)一步通過制粒機(jī)制粒，制粒機(jī)進(jìn)風(fēng)溫度60-80℃，出風(fēng)溫度45-70℃，制得顆粒產(chǎn)品。

本發(fā)明還提供了用于治療結(jié)腸癌及預(yù)防轉(zhuǎn)移的中藥制劑的片劑產(chǎn)品的制備方法，包括以下步驟：

1）將藤梨根、虎杖根、水楊梅根按1:1:1比例混合，每100kg混合后的原料中加入1000L水，浸泡20-40min后，用大火煮沸后改用小火繼續(xù)煎煮，小火煎20-40min，獲得藥液，將藥液過濾，濃縮至含生藥約1.2g/ml，得清膏；

2）將步驟1）中制得的清高取半份通過干燥機(jī)噴霧制粉，干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)風(fēng)溫度160-180℃，出風(fēng)溫度80-100℃，得浸膏粉；余下的另一半清膏與浸膏粉進(jìn)一步通過制粒機(jī)制粒，進(jìn)風(fēng)溫度60-80℃，出風(fēng)溫度45-70℃，制得顆粒產(chǎn)品；將制得的顆粒產(chǎn)品進(jìn)行壓片，規(guī)格0.48-0.52g/片，用高效包衣機(jī)包衣制得片劑產(chǎn)品。

本發(fā)明又提供了用于治療結(jié)腸癌及預(yù)防轉(zhuǎn)移的中藥制劑的口服劑產(chǎn)品的制備方法，包括以下步驟：

1）將藤梨根、虎杖根、水楊梅根按1:1:1比例混合，每100kg混合后的原料中加入1000L水，浸泡20-40min后，用大火煮沸后改用小火繼續(xù)煎煮，小火煎20-40min，獲得藥液，將藥液過濾，采用三效節(jié)能濃縮器濃縮至含生藥約1.2g/ml，冷卻至室溫，加入適當(dāng)常規(guī)輔料，用水配成口服劑。

其中，常規(guī)輔料可為在中藥口服劑中用于改善口感的輔料，例如蔗糖、蜂蜜等。

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述：

本發(fā)明是由以下重量份數(shù)的原料構(gòu)成：藤梨根20-40份；虎杖根20-40份；水楊梅根20-40份；優(yōu)選地，所述原料的重量份數(shù)為：藤梨根25-35份；虎杖根25-35份；水楊梅根25-35份；更優(yōu)選地，所述原料的重量份數(shù)為：藤梨根26-30份；虎杖根26-30份；水楊梅根26-30份。

此外，本發(fā)明所述原料的重量配比最優(yōu)為藤梨根：虎杖根：水楊梅根=1:1:1。

實(shí)施例1

將藤梨根、虎杖根、水楊梅根按1:1:1比例混合，每100kg混合后的原料中加入1000L水，浸泡20-40min后，用大火煮沸后改用小火繼續(xù)煎煮，小火煎20-40min，獲得藥液，將藥液過濾后用三效節(jié)能濃縮器濃縮，一效溫度80℃，二效溫度70℃，三效溫度60℃濃縮至含生藥濃度約1.2g/ml，得清膏，取半份清膏噴霧干燥制粉，進(jìn)風(fēng)溫度160-180℃，出風(fēng)溫度80-100℃，得浸膏粉；余下的另一半清膏與浸膏粉進(jìn)一步制粒機(jī)制粒，進(jìn)風(fēng)溫度60-80℃，出風(fēng)溫度45-70℃，制得顆粒。

實(shí)施例2

將藤梨根、虎杖根、水楊梅根按1:1:1比例混合，每100kg混合后的原料中加入1000L水，浸泡20-40min后，用大火煮沸后改用小火繼續(xù)煎煮，小火煎20-40min，獲得藥液，將藥液過濾后用三效節(jié)能濃縮器濃縮，一效溫度80℃，二效溫度70℃，三效溫度60℃濃縮至含生藥濃度約1.2g/ml，得清膏，取半份清膏噴霧干燥制粉，進(jìn)風(fēng)溫度160-180℃，出風(fēng)溫度80-100℃，得浸膏粉；余下的另一半清膏與浸膏粉進(jìn)一步制粒機(jī)制粒，進(jìn)風(fēng)溫度60~80℃，出風(fēng)溫度45~70℃，制得顆粒。制得顆粒后加入適量潤滑劑壓片，0.48~0.52g/片，用高效包衣機(jī)包衣制成，送檢，得片劑產(chǎn)品。

實(shí)施例3

將藤梨根、虎杖根、水楊梅根按1:1:1比例混合，每100kg混合后的原料中加入1000L水，浸泡20-40min后，用大火煮沸后改用小火繼續(xù)煎煮，小火煎20-40min，獲得藥液，將藥液過濾后用三效節(jié)能濃縮器濃縮汁每1mL藥液相當(dāng)于原藥材1.2g，放冷，加入適當(dāng)輔料，用水配置成口服劑。

實(shí)施例4

按照實(shí)施3制得的口服劑還可以制備成為含漱劑。

實(shí)施例5

按照實(shí)施3制得的口服劑還可以制備成為噴霧劑。

此外，本發(fā)明所述的原料藥還可按常規(guī)方法制成氣霧劑、噴霧劑、散劑、湯劑等。

通常，我們將本發(fā)明在中醫(yī)上稱為“解毒三根湯”，所述“解毒三根湯”為中醫(yī)醫(yī)生根據(jù)病人情況按照藤梨根、虎杖根、水楊梅根按1:1:1比例所開的中藥復(fù)方，按常規(guī)方法制成的湯劑，以下所述的解毒三根湯皆為此湯劑。

本發(fā)明產(chǎn)品治療結(jié)腸癌及預(yù)防轉(zhuǎn)移的臨床及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證情況：

1）臨床：

方法：在臨床五家三甲醫(yī)院進(jìn)行前瞻性隊(duì)列研究病例248例，設(shè)立中西醫(yī)結(jié)合治療組和純西醫(yī)治療組，中西醫(yī)結(jié)合治療組為正常西醫(yī)治療基礎(chǔ)上加解毒三根湯治療。對中晚期腫瘤患者治療生存期進(jìn)行調(diào)查收集。結(jié)果:在Ⅲ～Ⅳ期大腸癌患者1年生存率提高5.5％，2年生存率提高12.6%；證明解毒三根湯干預(yù)可以增加化療療效，改善患者的生活質(zhì)量，改善部分中醫(yī)癥狀，提高化療通過率。

結(jié)論:中藥復(fù)方“解毒三根湯制劑”治療結(jié)腸癌及預(yù)防轉(zhuǎn)移有明顯效果，且能明顯改善生活質(zhì)量、緩解疼痛、延長生存期。

2）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)1：探討解毒三根湯對結(jié)腸癌相關(guān)成纖維細(xì)胞IL-6、VEGF和對Caspase信號(hào)通路的影響

方法：以加入小鼠血清刺激48小時(shí)后的上清液和細(xì)胞為模型，將腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞及其上清液分為3組，包括正常對照組（A）、模型組（B）、中藥組（C），通過采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)觀察各組的上清液中IL-6、VEGF的含量；通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(reversetranscriptase-polymerasechainreaction，RT-PCR)實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞在caspase信號(hào)通路上對caspase-3、caspase-8的探討，觀察caspase-3、caspase-8的mRNA表達(dá)量。

結(jié)果：

1、解毒三根湯含藥血清對CAFs上清液中IL-6、VEGF含量的影響

ELISA法結(jié)果顯示，解毒三根湯含藥血清組對CAFs作用24小時(shí)及48小時(shí)后均能顯著降低IL-6、VEGF的含量，而模型組血清作用24小時(shí)、48小時(shí)后能促進(jìn)IL-6、VEGF含量的增加，其中正常對照組與模型組之間，模型組與中藥組之間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見說明書附圖1、圖2、圖3、圖4、圖5、圖6及表1、表2。

表1：解毒三根湯對細(xì)胞上清液作用24h和48h后對IL-6含量的影響（ng/L）(n=10)

注：*與A組比較P<0.01

☆與B組比較P<0.01

表2：解毒三根湯對細(xì)胞上清液作用24h和48h后對VEGF含量的影響（ng/L）(n=10)

注：*與A組比較P<0.01

☆與B組比較P<0.01

2、解毒三根湯含藥血清對Caspase-3及Caspase-8mRNA表達(dá)量的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法結(jié)果顯示，解毒三根湯含藥血清組能促使caspase-3及caspase-8mRNA表達(dá)量明顯增加，而其模型血清組則降低caspase-3及caspase-8mRNA的表達(dá)量，與正常對照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明解毒三根湯通過caspase-3及caspase-8的執(zhí)行而誘導(dǎo)CAFs的凋亡，結(jié)果見表3及圖7和圖8。

表3：解毒三根湯對Caspase-3mRNA和Caspase-8mRNA表達(dá)量的影響(n=10)

注：*與A組比較P<0.01

☆與B組比較P<0.01

結(jié)論：解毒三根湯具有抗結(jié)腸癌的效果，其機(jī)制可與降低結(jié)腸癌相關(guān)成纖維細(xì)胞IL-6、VEGF的表達(dá)，增強(qiáng)其在caspase信號(hào)通路上對caspase-3、caspase-8的執(zhí)行而誘導(dǎo)CAFs的凋亡有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)2：解毒三根湯干預(yù)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞TGF-β1、MMP-9、α-SMA抑制結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的研究

方法：BALB/c小鼠皮下接種CT-26結(jié)腸癌細(xì)胞(2×106mL)；隨機(jī)分為3組:正常對照組、模型組、解毒三根湯治療組，transwell觀察3組血清對CT-26細(xì)胞遷移力的影響，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）的建立：收集CT-26上清液，并以1：1比例與新鮮培養(yǎng)基配置條件培養(yǎng)基；收集對數(shù)生長期的小鼠成纖維L929細(xì)胞，用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)72小時(shí)建立腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）模型，ELISA檢測3組CAFs上清液中TGF-β1、MMP-9的表達(dá)量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各組CAFs中α-SMA、TGF-β1的mRNA表達(dá)量。

結(jié)果：

1、Transwell觀察各組CT-26細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示解毒三根湯含藥血清組的透膜結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞數(shù)量與模型組及正常對照組相比明顯減少，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；(見表4圖9、圖10、圖11及圖12，圖9為模型血清組的CT-26透膜細(xì)胞示意圖，圖10為正常血清對照組的CT-26透膜細(xì)胞示意圖，圖11為解毒三根湯血清組的CT-26透膜細(xì)胞示意圖，圖12為Transwell觀察的模型組、解毒三根湯血清組、正常對照組對結(jié)腸癌CT-26透膜細(xì)胞數(shù)量的影響。)

表4各組血清對結(jié)腸癌CT-26透膜細(xì)胞數(shù)量的影響(n=10)

注:與正常血清對照組比較，*P<0.01；

與模型血清組比較，**P<0.01；

2、各組CAFs上清液中TGF-β1、MMP-9表達(dá)量的比較

2.1、各組CAFs上清液中TGF-β1表達(dá)量的比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示解毒三根湯血清組刺激24小時(shí)的CAFs上清液中TGF-β1的表達(dá)量較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；48小時(shí)顯著降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）；24小時(shí)及48小時(shí)模型組上清液TGF-β1的表達(dá)量較解毒三根湯血清組及正常血清對照組均升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；(見表5圖13、圖14、圖15及圖16，圖13為24小時(shí)CAFs上清液中TGF-β1標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖14為48小時(shí)CAFs上清液中TGF-β1標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖15為24小時(shí)CAFs上清液中TGF-β1表達(dá)情況，圖16為48小時(shí)CAFs上清液中TGF-β1表達(dá)情況)。

表5各組CAFs上清液中TGF-β1表達(dá)情況的比較（單位：pg/ml）

注:與正常血清對照組比較，*P<0.01；

與模型血清組比較，**P＜0.05；

與模型血清組比較，***P＜0.01；

2.2各組CAFs上清液中MMP-9表達(dá)量的比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示24小時(shí)解毒三根湯血清組刺激的CAFs上清液中MMP-9的表達(dá)量較模型組降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；48小時(shí)顯著降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）；24小時(shí)及48小時(shí)模型組上清液MMP-9的表達(dá)量較解毒三根湯血清組及正常血清對照組均升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；(見表6、圖17、圖18、圖19及圖20，圖17為24小時(shí)MMP-9標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖18為48小時(shí)MMP-9標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖19為24小時(shí)CAFs上清液中MMP-9表達(dá)情況，圖20為48小時(shí)CAFs上清液中MMP-9表達(dá)情況)。

表6各組CAFs上清液中MMP-9表達(dá)情況的比較（單位：ng/ml）

注:與正常血清對照組比較，*P<0.01；

與模型血清組比較，**P<0.05；

與模型血清組比較，***P<0.01；

3各組CAFs中α-SMA、TGF-β1mRNA表達(dá)量的比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與正常血清對照組及模型血清組比較，解毒三根湯血清組可明顯降低α-SMA、TGF-β1mRNA的表達(dá)量，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，模型血清組與正常血清對照組比較α-SMA、TGF-β1mRNA的表達(dá)量明顯升高，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。(見表7、圖21及圖22，圖21為α-SMA基因相對表達(dá)量結(jié)果，圖22為TGF-β1基因相對表達(dá)量結(jié)果)。

表7各組CAFsα-SMA、TGF-β1mRNA的表達(dá)情況

注:與正常血清對照組比較，*P<0.01；

與模型血清組比較，**P<0.01；

結(jié)論：解毒三根湯降低CAFs上清液中TGF-β1、MMP-9的表達(dá)量，降低CAFs中α-SMAmRNA、TGF-β1mRNA的表達(dá)量，可能是其抑制腫瘤細(xì)胞遷移侵襲的機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)3：清熱解毒法基于Bcl-2/Bax等凋亡信號(hào)通路調(diào)控結(jié)腸癌的研究

方法：將BALB/c小鼠隨機(jī)分為用藥A組、用藥B組、用藥C組和模型D組。A、B、C組分別連續(xù)使用解毒三根湯灌胃5、7、10天后，與D組一起通過眼球取血獲得含藥血清，并作用于結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞，MTT法測細(xì)胞24h、48h、72h的抑制率，與未經(jīng)鼠血清刺激的正常CT-26細(xì)胞分別裂解蛋白后，Westernblot法檢測Bcl-2、Bax、P53、Caspase-3蛋白的表達(dá)量。

結(jié)果：

1解毒三根湯對結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞的抑制率

MTT法結(jié)果顯示，高濃度含藥小鼠血清有明顯抑制CT-26細(xì)胞增殖的作用，中、高濃度組其OD值與對照組、模型組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而解毒三根湯中、高濃度之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），以上說明解毒三根湯具有促進(jìn)CT-26細(xì)胞凋亡的作用，但尚未呈現(xiàn)劑量相關(guān)性（見圖23、圖24、圖25及表8，圖23為5天組作用24、48、72H后對細(xì)胞OD值的比較圖，圖24為7天組作用24、48、72H后對細(xì)胞OD值的比較圖，圖25為10天組作用24、48、72H后對細(xì)胞OD值的比較圖，注：OD值為吸光值，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)）。

表8解毒三根湯對結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞抑制率（×100%）的影響(n=18)

2解毒三根湯對CT-26細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3、P53蛋白含量的影響

Westernblot法結(jié)果顯示，解毒三根湯組含藥血清能顯著減少CT-26細(xì)胞中Bcl-2蛋白的含量。與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），與正常CT-26細(xì)胞比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說明解毒三根湯含藥血清有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞CT-26細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)作用。

同時(shí)，解毒三根湯組含藥血清能促進(jìn)CT-26細(xì)胞中Bax、P53蛋白的含量，分別與模型組、對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；解毒三根湯組含藥血清能促進(jìn)CT-26細(xì)胞中Caspase-3蛋白的含量，與正常對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜.05），與模型組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表9）。說明解毒三根湯含藥血清有促結(jié)腸癌細(xì)胞CT-26細(xì)胞中Bax、Caspase-3、P53的表達(dá)作用。

表9解毒三根湯對CT-26細(xì)胞中Bcl-2蛋白含量的影響(n=10)

注：與正常對照C組相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型B組相比，★P＜0.05，★★P＜0.01。

結(jié)論：解毒三根湯抑制結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞的生長可能與抑制Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)Bax、P53、Caspase-3的表達(dá)量有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)4：中醫(yī)解毒法優(yōu)化干預(yù)對BALB/c結(jié)腸癌小鼠CEA、sCD44的實(shí)驗(yàn)研究

方法：①皮下接種CT-26細(xì)胞于50只BALB/c小鼠建立移植瘤模型，分為五組：提前干預(yù)組10只、延后干預(yù)組10只、單純中藥組10只、單純化療組10只、模型對照組10只。同時(shí)增設(shè)陰性對照組10只。②五組移植瘤模型小鼠以及一組陰性對照組小鼠，治療期間定期監(jiān)測體重及瘤體變化。分組取血，分離血清，取瘤稱瘤重，計(jì)算抑瘤率。③ELISA法檢測各組血清CEA、sCD44含量。

結(jié)果：1腋下接種CT26細(xì)胞的BALB/c小鼠移植瘤模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果

課題組建立的是BALB/c小鼠腋下接種CT26的小鼠移植瘤動(dòng)物模型。當(dāng)接種到BALB/c小鼠右腋皮下時(shí)，發(fā)現(xiàn)100%成瘤，而且生長速度快，右腋皮下接種CT-26細(xì)胞5天后，開始可以觸及到米粒大小的腫塊，7天后腫瘤長至0.5cm3大小，造模成功。

2各組小鼠的體重變化情況的觀察結(jié)果

按照7天為一個(gè)治療階段，取每一階段的1、3、5、7天稱取小鼠體重。

2.1體重變化

圖26顯示的是各組小鼠自造模成功之日起至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重變化曲線(單位：g)，注：S代表階段，D代表這一階段第幾天。

用藥前小鼠總體體重為18.46±1.04g，組間無差異。治療結(jié)束后，各組體重由高到低依次為：單純中藥組、模型對照組、提前干預(yù)組、延后干預(yù)組、單純化療組。提前干預(yù)組和單純中藥組跟模型對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；延后干預(yù)組、單純化療組與模型對照組相比體重下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2去瘤體重變化

圖27和表10清晰顯示了各組小鼠治療前后的去瘤體重變化（注：*與模型對照組相比，P<0.05），（單位：g），注：*與模型對照組相比，P<0.05。圖中顯示：提前干預(yù)組和單純中藥組在治療后體重有所上升，和模型對照組的去瘤體重相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），延后干預(yù)組體重變化相差不明顯。

表10各組治療后體質(zhì)量比較（單位：g）

3實(shí)驗(yàn)小鼠瘤體變化以及抑瘤率觀察結(jié)果

各組小鼠皮下接種細(xì)胞5天后，腫瘤開始可以觸及，一周后可以被游標(biāo)卡尺測量。分別取第二、第三階段的1、3、5、7天測量腫瘤的長徑以及短徑，根據(jù)公式計(jì)算瘤體體積。

3.1瘤體體積變化

小鼠瘤體體積從可以被測量起組間無顯著性差異。治療結(jié)束時(shí)，各治療組的移植瘤從大到小依次為：模型對照組、單純中藥組、單純化療組、延后干預(yù)組、提前干預(yù)組。單藥化療組、單純中藥組與模型對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而兩藥合用組的抑制效果更好，提前干預(yù)組、延后干預(yù)組與模型對照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。表11為各組小鼠于造模過程中的瘤體體積變化（x±S）(單位：mm3)，并用圖28來表示該體積變化（x±S）(單位：mm3)，圖28為單純中藥組、模型對照組、提前干預(yù)組、延后干預(yù)組、單純化療組的小鼠于造模過程中的瘤體體積變化。

表11各組小鼠于造模過程中的瘤體體積變化（x±S）(單位：mm3)

注：與提前干預(yù)組相比，P<0.05；◇與模型對照組相比，P<0.05；與模型對照組相比，P<0.05；﹟與模型對照組相比，P<0.05；＊與模型對照組相比，P<0.05；☆與模型對照組相比，P<0.05。

3.2治療各組瘤體體積抑制率以及質(zhì)量抑制率結(jié)果

治療組的體積抑瘤率和質(zhì)量抑制率表現(xiàn)出一致性，從高到低分別為提前干預(yù)組、延后干預(yù)組、單純化療組、單純中藥組，表12及圖29表示了該變化的一致性，圖29為各組小鼠體積抑瘤率和質(zhì)量抑瘤率表示圖。

表12各組小鼠體積和質(zhì)量抑瘤率

注：抑瘤率=1-治療組/模型對照組×100%

4實(shí)驗(yàn)小鼠血清CEA及sCD44指標(biāo)的變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，治療各組血清CEA含量均高于陰性對照組，低于模型對照組。提前干預(yù)組、延后干預(yù)組、單純化療組與模型組相比較，CEA水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，單純中藥組和模型對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)各組的血清sCD44含量均高于空白組，低于模型對照組。以提前干預(yù)組、延后干預(yù)組最低，其次是單純中藥組，再次為單純化療組，其中提前干預(yù)組、延后干預(yù)組、單純化療組與模型對照組相比較，sCD44水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。單純中藥組和模型對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表13和圖30。圖30為各組小鼠血清CEA、sCD44水平，▲與模型對照組相比，P<0.05；■與模型對照組相比，P<0.05；●與陰性對照組相比，P<0.05；□與陰性對照組相比，P<0.05

表13各組小鼠血清CEA、CD44水平情況的比較（單位：ng/ml）

注：▲與模型對照組相比，P<0.05；■與模型對照組相比，P<0.05；●與陰性對照組相比，P<0.05；□與陰性對照組相比，P<0.05

結(jié)論：中醫(yī)解毒法協(xié)同化療能抑制腫瘤的作用機(jī)制可能與降低血清CEA、sCD44表達(dá)有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)5：中醫(yī)解毒法優(yōu)化干預(yù)對BALB/c結(jié)腸癌小鼠總生存期及Caspase-3、ROCK2、mTOR表達(dá)的影響。

方法：①皮下接種CT-26細(xì)胞于120只BALB/c小鼠建立移植瘤模型，分為六組：提前干預(yù)組20只、延后干預(yù)組20只、維持干預(yù)組20只、單純中藥組20只、單純化療組20只、模型對照組20只。②取六組移植瘤模型小鼠每組10只，治療后觀察生存期，繪制生存曲線。③免疫組化（SP法）及Westernblot法檢測瘤體Caspase-3、ROCK2、mTOR表達(dá)水平。

結(jié)果：1各組小鼠生存期觀察結(jié)果

從表14以及圖31（圖31為各組的生存曲線圖）可以看出，提前干預(yù)組的平均生存期以及中位生存期最長，為35.9±3.54天和36±3.58天，其次是單純中藥組，為34.5±3.72天和35±3.77天，再次是單純化療組，為31.2±3.42天和30±3.77天。延后干預(yù)組和維持干預(yù)組的生存期相似，均不如單純化療組長。結(jié)果顯示，提前干預(yù)組、單純中藥組、單純化療組能延長小鼠的生存期，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表14各組小鼠的平均生存期和中位生存期（單位：天）

注：●、◆表示與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）

2小鼠瘤體免疫組化結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，見表15及圖32（●與模型對照組相比，P<0.05；▲與模型對照組相比，P<0.05；★與模型對照組相比），圖32為各組移植瘤免疫組化的比較，P<0.05Caspase-3、ROCK2、mTOR均表達(dá)于癌細(xì)胞的胞漿中，表達(dá)率100%。Caspase-3陽性表達(dá)的提前組的瘤體中存在多中心小灶性壞死，表達(dá)量由高到低依次為提前干預(yù)組、單純化療組、延后干預(yù)組、單純中藥組，其中提前干預(yù)組、延后干預(yù)組、單純化療組和模型對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。ROCK2呈淡黃色至棕黃色顆粒，其表達(dá)量由低到高依次為：提前干預(yù)組、延后干預(yù)組、單純中藥組、單純化療組、模型對照組，其中提前干預(yù)組、延后干預(yù)組和模型對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。mTOR表達(dá)量由低到高依次為：提前干預(yù)組、延后干預(yù)組、單純化療組、單純中藥組、模型對照組，其中提前干預(yù)組、延后干預(yù)組與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表15：Caspase-3、ROCK2、mTOR在各組中的總光密度值變化情況（IOD）

注：●與模型對照組相比，P<0.05；▲與模型對照組相比，P<0.05；★與模型對照組相比，P<0.05

3小鼠瘤體蛋白Westernblot結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，見圖33及圖34，圖33中，分組從左到右依次為提前干預(yù)組、延后干預(yù)組、單純化療組、單純中藥組、模型對照組；從上到下條帶依次為beta-Actin、Caspase-3、ROCK2、mTOR，圖34為各組移植瘤內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)情況(IOD)，圖34中●與模型對照組相比，P<0.05；▲與模型對照組相比，P<0.05；★與模型對照組相比，P<0.05。提前干預(yù)組、延后干預(yù)組、單純化療組均能上調(diào)Caspase-3表達(dá)，單純中藥組對上調(diào)Caspase-3并不顯著。其中提前干預(yù)組、延后干預(yù)組和模型對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Westernblot顯示：ROCK2的表達(dá)量從低到高依次為提前干預(yù)組、延后干預(yù)組、單純中藥組、單純化療組，模型對照組。治療各組均下調(diào)ROCK2表達(dá)，以提前干預(yù)組、延后干預(yù)組下調(diào)作用最明顯，其次是單純中藥組，以上三組和模型對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。此外，各治療組的mTOR表達(dá)水平均有下降，各治療組中又以提前干預(yù)組的下調(diào)作用最明顯，其次是延后干預(yù)組、單純化療組，提前干預(yù)組、延后干預(yù)組、單純化療組和模型對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

注：分組從左到右依次為提前干預(yù)組、延后干預(yù)組、單純化療組、單純中藥組、模型對照組；從上到下條帶依次為beta-Actin、Caspase-3、ROCK2、mTOR

注：●與模型對照組相比，P<0.05；▲與模型對照組相比，P<0.05；★與模型對照組相比，P<0.05

結(jié)論：①化療前應(yīng)用解毒法能延長總生存期，起到減毒增效的作用。單獨(dú)運(yùn)用中醫(yī)解毒法可以緩解疾病進(jìn)展，延長生存時(shí)間，達(dá)到“帶瘤生存”。②中醫(yī)解毒法協(xié)同化療能延長生存期的作用機(jī)制可能與上調(diào)腫瘤促凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)，下調(diào)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白R(shí)OCK2表達(dá)，下調(diào)增殖相關(guān)蛋白mTOR表達(dá)有關(guān)。

總之，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所作的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明專利的涵蓋范圍。