技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物信息學(xué)領(lǐng)域，具體涉及基因單堿基突變的檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物信息學(xué)領(lǐng)域，具體涉及基因單堿基突變的檢測(cè)。

背景技術(shù)：

目前，在家畜的遺傳育種中，應(yīng)用分子標(biāo)記的現(xiàn)代育種技術(shù)是加快良種選育和提高種群遺傳品質(zhì)，從而增加家畜生產(chǎn)性能先進(jìn)的有效的方法。應(yīng)用分子標(biāo)記育種首先是在DNA水平上篩查和檢測(cè)牛經(jīng)濟(jì)性狀密切相關(guān)的遺傳標(biāo)記；其次是建立其基因多態(tài)性的快速檢測(cè)方法；然后實(shí)現(xiàn)遺傳標(biāo)記輔助選擇和實(shí)現(xiàn)早期診斷選擇。

SNP的檢測(cè)方法有很多種，大多數(shù)方法以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為主要基礎(chǔ)，利用堿基差異造成的DNA片段的各種差異來(lái)進(jìn)行SNP檢測(cè)和分析，如下所述：（1）單鏈構(gòu)象多態(tài)性。實(shí)驗(yàn)證明300bp以下的DNA片段中的單堿基突變，單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)方法檢出率幾乎100%，但300bp以上的片段檢出率則不高，甚至還會(huì)出現(xiàn)漏檢的情況；此外，其操作繁瑣，需要特殊儀器；所用試劑包含有硝酸銀和甲醛，易對(duì)人體健康造成危害；PCR產(chǎn)物電泳之前需進(jìn)行特殊處理；電泳溫度高低和凝膠濃度大小等均可影響其靈敏度的高低；實(shí)驗(yàn)重復(fù)效果不好。（2）創(chuàng)造酶切位點(diǎn)PCR法。其關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于錯(cuò)配引物的設(shè)計(jì)，引物只能固定在突變位點(diǎn)的鄰近序列設(shè)計(jì)。創(chuàng)造酶切位點(diǎn)PCR法穩(wěn)定性高，結(jié)果準(zhǔn)確，但是由于人為地引入了錯(cuò)配堿基，與正常引物相比，其擴(kuò)增難度很高，擴(kuò)增效率大大降低，將會(huì)直接影響到酶切的結(jié)果。(3)綜上所述，以上方法均不是一種檢測(cè)SNPs的理想的遺傳標(biāo)記方法。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，此檢測(cè)方法結(jié)合PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法，檢測(cè)單堿基突變的效率可以達(dá)到100%。此方法的關(guān)鍵是使用PCR將編碼區(qū)域的序列在不同個(gè)體當(dāng)中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與原來(lái)序列進(jìn)行比對(duì)分析，以準(zhǔn)確確定堿基突變的位置。PCR-RFLP具有快速，準(zhǔn)確，方法簡(jiǎn)便，重復(fù)性高，成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，大量樣本的分析可以用此種方法。

CSRP家族成員在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中均起重要作用。研究表明CSRP3基因（又叫肌肉特異性LIM蛋白（muscleLIMprotein，MLP）僅在肌中表達(dá)，且其表達(dá)與肌分化過(guò)程相一致，是一個(gè)肌發(fā)生的正調(diào)節(jié)因子(Arberetal.,1994）。另有研究表明，CSRP3基因編碼產(chǎn)物MLP可以通過(guò)一種物理的方式與肌肉組織基本的螺旋一環(huán)一螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生作用，這種作用具有高度的特異性，即MLP不與非肌源性bHLH蛋白或成肌增強(qiáng)因子2發(fā)生作用(Kongetal.,1997)。MLP可能以共激活因子的形式促進(jìn)肌源性bHLH蛋白與特定DNA調(diào)控元件的結(jié)合(Kongetal.,1997)。由此，我們推測(cè)該基因可能對(duì)牛肌肉生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響，值得深入研究。但是到目前為止，有關(guān)牛CSRP3基因的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種牛CSRP3基因單堿基突變的檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單易行，成本低，時(shí)間短，重復(fù)性高，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，極容易判型，便于推廣應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)，該方法包括以下步驟：

（1）根據(jù)牛CSRP3基因在基因組序列中的位置，設(shè)計(jì)一對(duì)基因特異性引物；

所述的一對(duì)基因特異性引物如下：

上游引物CSRP3-GSP-F：5'-CACAGGTCAGGAATCAAAG-3'19bp；

下游引物CSRP3-GSP-R：5'-GCAAAGGTCAAACAATAGG-3'19bp。

（2）以包含牛CSRP3基因的DNA序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

所述PCR反應(yīng)體系為15μL，其中包括2×ReactionMix7.5μL，ddH2O6.1μL，上游引物CSRP3-GSP-F0.3μL，下游引物CSRP3-GSP-R0.3μL，GoldenDNApolymerase0.3μL，含CSRP3基因序列的DNA模板0.5μL。

以上各成分混勻后，進(jìn)行分裝，每管總體積15μL。放入PTC-200PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，60℃退火40s，72℃延伸40s，共計(jì)36個(gè)循環(huán)，72℃充分延伸10min，最后16℃保存待用。

（3）通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)牛CSRP3基因單堿基突變，當(dāng)在PCR產(chǎn)物中加入限制性?xún)?nèi)切酶HhaI進(jìn)行消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小分離與鑒定，電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種不同條帶，分別對(duì)應(yīng)著3種不同基因型（野生純合基因型AA，突變純合基因型GG，雜合基因型AG）。隨后，挑取不同帶型送測(cè)序驗(yàn)證，利用生物信息學(xué)方法，將測(cè)序結(jié)果與NCBI公布的序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)該CSRP3基因第2外顯子區(qū)域即第14832位發(fā)生了A＞T突變。電泳結(jié)果與測(cè)序結(jié)果相一致。

步驟（3）所述的檢測(cè)牛CSRP3基因單堿基突變的PCR-RFLP方法，所述的瓊脂糖凝膠濃度為3%。

本發(fā)明的技術(shù)方案還在于采用了一種牛CSRP3基因單堿基突變檢測(cè)方法的應(yīng)用，所述的檢測(cè)方法可用于牛的輔助選擇和良種選育。通過(guò)將不同基因型與牛的不同性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，從而確定基因與性狀的對(duì)應(yīng)關(guān)系，用于牛的良種選育。

步驟（5）所述的不同性狀包括包括生長(zhǎng)和胴體性狀。

本發(fā)明的檢測(cè)方法先用PCR擴(kuò)增，然后用限制性?xún)?nèi)切酶HhaI直接消化PCR產(chǎn)物，消化后的產(chǎn)物直接跑瓊脂糖凝膠電泳。根據(jù)電泳結(jié)果，挑取不同帶型送測(cè)序驗(yàn)證，便可鑒定秦川肉牛和中國(guó)荷斯坦奶牛CSRP3基因第14832位的單堿基突變情況。該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單易行，成本低，時(shí)間短，重復(fù)性高，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，極容易判型，便于推廣應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1為牛血液基因組DNA電泳檢測(cè)圖。

圖2為牛CSRP3基因第2外顯子區(qū)域607bpPCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖3為秦川肉牛CSRP3基因第2外顯子區(qū)域607bpPCR產(chǎn)物經(jīng)HhaI酶切消化后的3%瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖4為中國(guó)荷斯坦奶牛CSRP3基因第2外顯子區(qū)域607bpPCR產(chǎn)物經(jīng)HhaI酶切消化后的3%瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖5為牛CSRP3基因第2外顯子區(qū)域即g.14832位堿基突變位點(diǎn)野生純合AA基因型測(cè)序結(jié)果圖。

圖6為牛CSRP3基因第2外顯子區(qū)域即g.14832位堿基突變位點(diǎn)雜合AG基因型測(cè)序結(jié)果圖。

圖7為牛CSRP3基因第2外顯子區(qū)域即g.14832位堿基突變位點(diǎn)突變純合GG基因型測(cè)序結(jié)果圖。

圖8為牛CSRP3基因第2外顯子區(qū)域即g.14832位堿基突變位點(diǎn)的DNA序列分析。

下面結(jié)合附圖說(shuō)明和發(fā)明人給出的最佳實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施例部分包括實(shí)施例，驗(yàn)證實(shí)施例，應(yīng)用實(shí)施例，各實(shí)施例是為了更清楚的說(shuō)明本發(fā)明，以使公眾對(duì)發(fā)明內(nèi)容從整體上得到充分的理解，而并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例中所用的主要試劑來(lái)源：

一、常用試劑和溶液的配制

試劑和溶液的配制方法具體如下：

（1）ACD抗凝劑

檸檬酸2.4g，檸檬酸鈉6.6g，葡萄糖7.35g，加水定容至50mL蒸餾水中，采集血樣時(shí)，在新鮮血液中按一定比例加入ACD。

（2）PBS緩沖液

NaCl4g，KCl0.1g，Na2HP040.72g，KH2P040.12g，加滅菌過(guò)的蒸餾水定容至500mL，用pH試紙調(diào)pH至7.4，120℃高壓滅菌20min。

（3）DNA抽提液

分別量取1mmol/LTris·Cl100mL，5mmol/LNaCl40mL，0.5mmol/LEDTA400mL，10%十二烷基磺酸鈉100mL，定容至1000mL。pH值用NaOH調(diào)為8.0。

（4）蛋白酶K

加5mL滅菌蒸餾水，稀釋成20mg/mL，放入-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（5）70%乙醇

無(wú)水乙醇350mL，加蒸餾水150mL定容至500mL。

（6）10×TBE緩沖液

稱(chēng)取Tris54g，硼酸27.5g，EDTA·Na23.72g，加熱混勻，保存?zhèn)溆谩?/p>

二、軟件工具

（1）引物設(shè)計(jì)軟件

PrimerPremier5.0軟件自行設(shè)計(jì)上下游引物；

（2）序列分析軟件

DNAStar7.10軟件進(jìn)行序列比對(duì)和突變位點(diǎn)分析；

（3）統(tǒng)計(jì)分析軟件

EXCELL用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；SPASS17.0進(jìn)行各性狀指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)和分析，以及差異顯著性檢驗(yàn)。

實(shí)施例1：牛血液樣本采集和DNA提取以及構(gòu)建混合DNA池

一、牛血液樣本采集

2008年9月至2012年6月，分別在陜西省秦寶牧業(yè)發(fā)展有限公司和西安草灘奶牛場(chǎng)采集血樣，先后共采集秦川肉牛血樣404份，中國(guó)荷斯坦奶牛血樣150份。50mL全血中加入1.5mL的ACD抗凝劑，混勻后置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，存放于-80℃保存。

二、牛血液基因組DNA提取

血液基因組DNA提取過(guò)程具體步驟如下：

（1）將血樣在半凍融狀態(tài)下，吸1000μL血液于2mL的滅菌離心管中；

（2）再向滅菌管中加入PBS緩沖液1000μL，使總體積達(dá)到2000μL，輕搖10min；之后4℃，12000rpm離心10min；

（3）棄上清，重復(fù)上面的步驟2-3次，直到上清液變清亮；

（4）分別加DNA抽提液800μL，蛋白酶K15μL，混勻后，放入恒溫水浴箱中56℃過(guò)夜消化蛋白質(zhì)等，當(dāng)溶液變得澄清透明時(shí)，便可拿出；

（5）加入1000μL的Tris飽和酚，放在冰上溫和搖動(dòng)10min；之后4℃，12000rpm離心10min；用移液器小心吸取上清液到滅菌離心管中；

（6）加入500μL的Tris飽和酚和500μL的氯仿，放在冰上溫和搖動(dòng)10min；之后4℃，12000rpm離心10min；用移液器小心吸取上清液到另一個(gè)滅菌的離心管中；

（7）加入1000μL的氯仿，放在冰上溫和搖動(dòng)10min；之后4℃，12000rpm離心10min；用移液器小心吸取上清液到另一個(gè)滅菌的離心管中；

（8）加入2倍體積的無(wú)水乙醇，上下顛倒數(shù)次使DNA析出；之后4℃，12000rpm離心10min，棄去乙醇；

（9）加入70%的乙醇1mL，溫和搖動(dòng)10min；之后4℃，12000rpm離心10min，重復(fù)漂洗一次；

（10）室溫下讓乙醇揮發(fā)干凈，加入一定量滅菌水溶解DNA，完全溶解后測(cè)定濃度和純度。

三、紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度

以80ng/μL作為標(biāo)準(zhǔn)DNA濃度，若測(cè)得的DNA濃度在80ng/μL左右，說(shuō)明DNA濃度符合實(shí)驗(yàn)要求；濃度過(guò)高的需要稀釋成標(biāo)準(zhǔn)濃度；濃度過(guò)低的需重新提取DNA。

若A260nm/A280nm比值在1.6～2.0之間時(shí)，可判定DNA的純度基本符合要求。若A260nm/A280nm比值小于1.6或者大于2.0時(shí)，可判定純度不符合要求。必須對(duì)樣品DNA做進(jìn)一步的純化，或重新提取DNA。

四、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA的質(zhì)量

（1）稱(chēng)取0.5g的瓊脂糖，轉(zhuǎn)入三角瓶中，再加入1×TBE20mL使其懸浮，微波爐加熱60秒，待溶液沸騰呈透明狀時(shí)拿出。

（2）將液體倒入制膠板中，插上梳子，待瓊脂糖完全冷卻凝固，拔掉梳子，將凝膠移入電泳槽中。

（3）向電泳槽中加入1×TBE緩沖液，使液面高出膠面5mm。

（4）取DNA樣品5μL，加3μL上樣緩沖液后，混勻上樣。

（5）120V電壓電泳30min。

（6）在凝膠成像系統(tǒng)上觀察，如果電泳條帶清晰而規(guī)則，沒(méi)有明顯拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明提取的DNA效果較好，可以滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需要，否則需重新提取相應(yīng)樣品的DNA。

五、構(gòu)建混合DNA池

本發(fā)明的詳細(xì)DNA池構(gòu)建方法如下：將提取的基因組DNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量每個(gè)DNA樣品濃度各3次，取平均值，再將樣品稀釋到終濃度為80ng/μL，20個(gè)DNA樣品中各取2μL快速構(gòu)建成DNA池。以池中DNA樣品為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并送去測(cè)序，快速篩查基因的SNPs。

結(jié)果：牛血液基因組DNA的電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

實(shí)施例2：牛CSRP3基因第2外顯子的PCR擴(kuò)增

一、引物設(shè)計(jì)

以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中GenBank公布的牛（登錄號(hào)：AC_000186.1）序列為參考，利用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)牛CSRP3基因第2外顯子的PCR引物，其引物序列如下：

上游引物CSRP3-GSP-F：5'-CACAGGTCAGGAATCAAAG-3'19bp；

下游引物CSRP3-GSP-R：5'-GCAAAGGTCAAACAATAGG-3'19bp。

該引物對(duì)擴(kuò)增了牛CSRP3基因整個(gè)第2外顯子區(qū)域，片段大小為607bp。

二、PCR擴(kuò)增

（1）PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系采用混合加樣法，實(shí)驗(yàn)中我們通常是先計(jì)算出每一種成份所需要的量，然后再算出加樣總量，之后等量分裝到每一個(gè)PCR管，然后加

入模板DNA，再瞬時(shí)離心后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如表1。

表1PCR反應(yīng)體系

成分體積2×ReactionMix7.5μLddH2O6.1μL引物上游0.3μL引物下游0.3μLGoldenDNApolymerase0.3μL個(gè)體或混合DNA模板0.5μL總體積15μL

（2）PCR反應(yīng)程序

95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，60℃退火40s，72℃延伸40s，共36個(gè)循環(huán)，72℃充分延伸10min，最后16℃保存待用。PCR反應(yīng)程序見(jiàn)表2。

表2PCR反應(yīng)程序

步驟溫度時(shí)間預(yù)變性95℃5min變性94℃30s退火60℃40s延伸72℃40s充分延伸72℃10min保存待用16℃Forever

結(jié)果：PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2為牛CSRP3基因第2外顯子區(qū)域607bpPCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳圖。從左至右方向，泳道1表示MarkerI（自上而下分別代表600bp～100bp）；泳道2～8為607bpPCR產(chǎn)物。

電泳結(jié)果表明：PCR片段的大小為607bp，與預(yù)期理論設(shè)計(jì)的片段大小完全一致。因此，成功擴(kuò)增出牛CSRP3基因第2外顯子區(qū)域DNA片段。

實(shí)施例3：生物信息學(xué)分析

（1）測(cè)序驗(yàn)證

分別以個(gè)體和混合DNA池中DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣于1%的瓊脂糖凝膠，120V電壓電泳30min，核酸燃料染色，然后進(jìn)行切膠回收，回收后的產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技公司進(jìn)行正向測(cè)序，測(cè)序使用的是ABI3730型全自動(dòng)序列分析儀。

（2）篩查突變位點(diǎn)

根據(jù)個(gè)體和混合DNA池模板測(cè)序后的峰圖結(jié)果，以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中GenBank公布的牛AC_000186.1序列為參考，利用DNAStar7.10軟件將測(cè)序后序列與公布的參考序列進(jìn)行DNA序列比對(duì)和突變位點(diǎn)分析，結(jié)果篩查到在基因組第14832位發(fā)生一處單堿基A>G突變，突變的具體位置見(jiàn)圖8。（圖8為牛CSRP3基因第2外顯子區(qū)域即g.14832位堿基突變位點(diǎn)的DNA序列分析。圖中的下劃線部分分別表示上下游引物F和R；灰色陰影部分為完整的第2外顯子區(qū)域；方框顯示的是g.14832位A>G堿基突變位點(diǎn)。）為進(jìn)一步驗(yàn)證堿基突變位點(diǎn)的變異情況，在404頭秦川肉牛群體和150頭中國(guó)荷斯坦奶牛群體中均進(jìn)行了下一步的應(yīng)用驗(yàn)證。

實(shí)施例4：牛CSRP3基因g.14832位的HhaI限制性?xún)?nèi)切酶消化

利用實(shí)施例2中的引物和PCR擴(kuò)增條件，對(duì)實(shí)施例1中秦川肉牛的404份和150份中國(guó)荷斯坦奶?；蚪MDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共獲得554份個(gè)體的牛CSRP3基因中包含g.14832A>G突變位點(diǎn)的DNA片段，然后利用如下方法進(jìn)行HhaI限制性?xún)?nèi)切酶消化，具體方法如下：

（一）PCR產(chǎn)物進(jìn)行HhaI限制性?xún)?nèi)切酶消化

（1）HhaI酶切消化體系

酶切前，先隨機(jī)進(jìn)行小樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的抽檢，目的是通過(guò)隨機(jī)抽檢的方式，檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物是否擴(kuò)增出目的片段。

其次，在PCR產(chǎn)物中加入酶切反應(yīng)各個(gè)組分，進(jìn)行酶切消化反應(yīng)，酶切體系如下：

表3HhaI限制性?xún)?nèi)切酶消化體系

組分體積HhaI1μL10×MBuffer2μLPCR產(chǎn)物≤1μg滅菌水upto20μL總體積20μL

（2）酶切反應(yīng)

將（1）中各成分混勻后，瞬時(shí)離心，放入37℃隔水式培養(yǎng)箱中反應(yīng)1小時(shí)。1小時(shí)后向PCR管中添加10×LoadingBuffer（使用時(shí)添加反應(yīng)液量的1/10），即可停止反應(yīng)，進(jìn)行電泳。

（3）酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

A.裝板

事先將制膠板和梳子清洗干凈，晾干備用。

B.配膠

根據(jù)不同長(zhǎng)度的PCR擴(kuò)增片段配制適合濃度的膠。最適合的膠濃度是經(jīng)過(guò)多次的摸索條件得來(lái)的，根據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，此實(shí)驗(yàn)中607bp長(zhǎng)度的片段適合的膠濃度為3%。

稱(chēng)取瓊脂糖0.9g，倒入三角錐形瓶中，同時(shí)加入1×TBE緩沖液30mL;之后，將三角錐形瓶放入微波爐中加熱1min至完全沸騰狀態(tài)，隨后待溫度降至60度左右時(shí)加入核酸染料3μL。

C.倒膠

倒膠時(shí)，注意不能產(chǎn)生氣泡，如果產(chǎn)生氣泡用白槍頭挑破或?qū)馀萏糁林颇z板的四周，之后立即插上梳子，要保證梳子齒和液面接觸處沒(méi)有氣泡，一旦產(chǎn)生氣泡要拔出重插。

D.靜置

靜置水平桌面上15min左右使之充分凝固。

E.準(zhǔn)備電泳

瓊脂糖凝固后即可拔出梳子，拔梳子時(shí)要用力均勻以保持膠孔的整齊。將瓊脂糖放入電泳槽中固定好，倒入1×TBE電泳緩沖液需高出膠面5mm，速度要慢，以免梳子孔中進(jìn)入氣泡，產(chǎn)生的大氣泡會(huì)使電泳條帶彎曲。

F.點(diǎn)樣

用微量加樣器把酶切消化產(chǎn)物按順序加到點(diǎn)樣孔中。由于邊緣效應(yīng)帶型不整齊，每塊板中最邊上的兩個(gè)孔最好不要點(diǎn)樣。

G.電泳

電壓調(diào)至120V，室溫電泳30min。

（二）凝膠成像系統(tǒng)照相分析

利用北京伯樂(lè)公司T2A型凝膠成像系統(tǒng)照相分析，并做好記錄和帶型統(tǒng)計(jì)。

牛CSRP3基因的g.14832位堿基發(fā)生A＞G突變時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)HhaI酶切消化后產(chǎn)生不同的帶型。由于牛為二倍體，所以牛基因組的CSRP3基因的第14832位發(fā)生堿基突變后的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果為：如圖3所示，

從左至右方向，泳道1～7，10～11為野生純合AA基因型；泳道8～9為雜合AG基因型；泳道12為突變純合GG基因型；泳道13代表MarkerI。圖4中，從左至右方向，泳道1～12為野生純合AA基因型個(gè)體的酶切產(chǎn)物；泳道13代表MarkerI。

驗(yàn)證實(shí)施例：不同帶型個(gè)體PCR產(chǎn)物的測(cè)序驗(yàn)證

利用ABI3730型測(cè)序儀對(duì)不同帶型個(gè)體的PCR產(chǎn)物進(jìn)行正向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如圖4所示。箭頭的指示位置表示基因組第14832位堿基；圖5表示野生純合AA基因型測(cè)序結(jié)果；圖6表示雜合AG基因型測(cè)序結(jié)果；圖7表示突變純合GG基因型測(cè)序結(jié)果。

應(yīng)用實(shí)施例1：牛CSRP3基因g.14832位點(diǎn)的基因型頻率統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)實(shí)施4中的酶切電泳結(jié)果，統(tǒng)計(jì)秦川肉牛和中國(guó)荷斯坦奶牛共計(jì)554個(gè)體在g.14832位點(diǎn)的基因型頻率，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下：

表4牛CSRP3基因g.14832位點(diǎn)的基因型頻率統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用實(shí)施例2：不同基因型與生長(zhǎng)和胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析

生長(zhǎng)指標(biāo)包括：體高，體斜長(zhǎng)，腰角寬；胴體性狀指標(biāo)包括：空腹24h宰前活重，胴體重，屠宰率；此數(shù)據(jù)資料在秦川肉牛屠宰前，由本實(shí)驗(yàn)室人員進(jìn)行當(dāng)天測(cè)量并記錄。測(cè)量工具為測(cè)杖、卷尺和鋼尺。

關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見(jiàn)表5，實(shí)驗(yàn)采用SPSS17.0軟件對(duì)不同基因型與各性狀指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，以及差異顯著性檢驗(yàn)。

表5牛CSRP3因不同基因型與生長(zhǎng)和胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析

注：A，B同一行中肩標(biāo)字母相同者表示差異不顯著（P>0.05），不同字母表示差異極顯著（P<0.01）；

a，b同一行中肩標(biāo)字母相同者表示差異不顯著（P>0.05），不同字母表示差異顯著（P<0.05）。

關(guān)聯(lián)結(jié)果表明，在體高和體斜長(zhǎng)兩個(gè)生長(zhǎng)性狀指標(biāo)上，3種基因型之間無(wú)顯著差異（P>0.05）；腰角寬指標(biāo)上，AG基因型個(gè)體與GG基因型個(gè)體達(dá)到差異顯著水平（P＜0.05）。在胴體性狀中，空腹24h宰前活重指標(biāo)上，不同基因型之間未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異顯著水平（P>0.05）；胴體重上，GG基因型個(gè)體與AA、AG基因型個(gè)體達(dá)到了統(tǒng)計(jì)學(xué)的極顯著水平（P＜0.01）；屠宰率指標(biāo)上，AA型個(gè)體與GG型個(gè)體達(dá)到了統(tǒng)計(jì)學(xué)的極顯著水平（P＜0.01），AG型個(gè)體與GG型個(gè)體達(dá)到了統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著水平（P＜0.05）。在這幾項(xiàng)指標(biāo)中，GG基因型個(gè)體的各指標(biāo)平均數(shù)值普遍地高于其它2種基因型，這說(shuō)明GG基因型在整個(gè)秦川牛群體中處于優(yōu)勢(shì)地位，是優(yōu)勢(shì)基因型，所以在牛的發(fā)育早期，我們應(yīng)盡可能的多選GG基因型個(gè)體留作種用，使整個(gè)牛群具有良好的生長(zhǎng)發(fā)育狀況和較好的胴體品質(zhì)，從而加快具有優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)性狀牛種群的建立。

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