技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于環(huán)境水體質(zhì)量的檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種環(huán)境水體中CVA16病毒的檢測方法。

技術(shù)背景

柯薩奇病毒A16型（CVA16）是引起手足口疾病的主要病原體之一，隸屬于腸道病毒屬。CVA16是一種水媒傳播病毒，它可從受CVA16感染的病人分泌物泄入環(huán)境水體中，且可在環(huán)境水體中生存較長時間。受其污染的水體成為CVA16的一個重要污染源，可引發(fā)手足口疾病的爆發(fā)。

現(xiàn)有檢測CVA16的方法主要有細(xì)胞培養(yǎng)法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction，PCR)。環(huán)境水體中存在多種病原微生物，尤其是其他腸道病毒，這些微生物對細(xì)胞培養(yǎng)檢測CVA16有干擾作用的，細(xì)胞培養(yǎng)法很難對其區(qū)分鑒定。PCR方法廣泛應(yīng)用于CVA16的檢測。但，現(xiàn)有的PCR檢測技術(shù)主要應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，檢測樣本基本來自人體分泌物，而環(huán)境水體中CVA16濃度低，檢測影響因素復(fù)雜，現(xiàn)有的PCR檢測方法不能對環(huán)境水體中CVA16進(jìn)行準(zhǔn)確定性或定量檢測。目前還沒有適合用于對環(huán)境水體中CVA16的檢測方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種環(huán)境水體中CVA16病毒的檢測方法。

為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)任務(wù)，本發(fā)明采取的技術(shù)解決方案如下：

步驟一，樣品處理：

（1）病毒濃縮：首先在4℃條件下于VmL的待檢測水樣中加入質(zhì)量百分比為8%的聚乙二醇和質(zhì)量百分比為2.3%的氯化鈉并混勻，接著將待檢測水樣在4℃條件下進(jìn)行離心處理，棄上清液，用1mL超純水重懸沉淀得到病毒濃縮液，其中50≤V≤250；

（2）RNA提?。菏褂肦NA提取試劑盒從病毒濃縮液中提取RNA；

（3）逆轉(zhuǎn)錄：將5μL的RNA、2μL的5×gDNAEraserBuffer、1μL的5×gDNAEraserBuffer和2μL的RNaseFreedH2O在42℃條件下反應(yīng)2min得到反應(yīng)液，將該反應(yīng)液與4μL的5×Buffer、1μL的RTEnzymeMix、1μL的RTPrimerMix和4μL的RNaseFreedH2O混合進(jìn)行反應(yīng)：先在37℃條件下反應(yīng)15min；接著在85℃條件下反應(yīng)5s，得到cDNA；

步驟二，定性檢測

（1）將2.5μL的10×ExTaqBuffer、2μL的dNTPMixture、0.25μL的ExTaq、400nM的上游引物CVA16-F1、400nM的下游引物CVA16-R和2μL步驟一所獲得的cDNA混合，接著用無菌超純水補(bǔ)足至25μL，在梯度PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，同時以無菌超純水作為陰性對照；PCR反應(yīng)條件為：

①95℃預(yù)變性5min；

②擴(kuò)增循環(huán)35次，每輪循環(huán)的反應(yīng)條件依次為：95℃，30s、56℃，30s、72℃，60s；

③在72℃延伸5min，反應(yīng)產(chǎn)物為PCR產(chǎn)物一；

其中：

上游引物CVA16-F1的核苷酸序列為：

5’-TGGGAYATTGAYTTGATGGG-3’；

下游引物CVA16-R的核苷酸序列為：

5’-GACATGAAGGGKACTGACACTTG-3’；

（2）將2.5μL的10×ExTaqBuffer、2μL的dNTPMixture、0.25μL的ExTaq、400nM的上游引物CVA16-F2、400nM的下游引物CVA16-R和0.2μLPCR產(chǎn)物一混合，接著用無菌超純水補(bǔ)足至25μL，在梯度PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，同時以無菌超純水作為陰性對照；其中的PCR反應(yīng)條件為：

①95℃預(yù)變性5min；

②擴(kuò)增循環(huán)35次，每輪循環(huán)的反應(yīng)條件依次為：95℃，30s、58℃，30s、72℃，60s；

③在72℃延伸5min，擴(kuò)增產(chǎn)物為PCR產(chǎn)物二；

其中：上游引物CVA16-F2的核苷酸序列為：

5’-CAAACCRAAYGGTGAGYTAGT-3’；

（3）將所得的PCR產(chǎn)物二用含體積濃度2%GelRed核酸染料的瓊脂糖凝膠跑電泳，在凝膠成像儀下拍照，并將電泳條帶切割膠純化回收，得膠純化回收產(chǎn)物；

（4）采用雙脫氧終止法對所得膠純化回收產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列測定，將所測得的核苷酸序列在NCBI基因庫經(jīng)BLAST比對，當(dāng)所測得的核酸序列與CVA16病毒基因相似度大于70%時，待檢測水樣中存在CVA16，繼續(xù)依次進(jìn)行后續(xù)步驟三和步驟四，否則，待檢測水樣中不存在CVA16；

步驟三，標(biāo)準(zhǔn)品制備：

（1）第一輪PCR擴(kuò)增：以步驟一獲得的cDNA為模板，利用上游引物CVA16-F1和下游引物CVA16-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到第一輪擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物；

（2）第二輪PCR擴(kuò)增：以第一輪擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物為模板，利用上游引物CVA16-F2和下游引物CVA16-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到第二輪擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物；

（3）將所得的第二輪擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用含體積濃度為2%的GelRed核酸染料的瓊脂糖凝膠跑電泳，在凝膠成像儀下拍照確認(rèn)目的條帶，之后切割目的條帶并純化回收，得到目的片段回收產(chǎn)物，該目的片段回收產(chǎn)物的長度為m（bp）；

（4）將目的片段回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，采用藍(lán)白斑篩選法篩選出轉(zhuǎn)化進(jìn)插入目的片段的載體的菌落，將陽性菌在含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中于37℃條件下培養(yǎng)12～16小時得到菌液，接著用質(zhì)粒提取試劑盒從菌液中提取質(zhì)粒；其中LB液體培養(yǎng)基中卡那霉素的質(zhì)量濃度為50μg/mL；

（5）采用雙脫氧終止法對得到的質(zhì)粒的核苷酸序列進(jìn)行測定，將所測得的核苷酸序列在NCBI基因庫經(jīng)BLAST比對，

當(dāng)所測得的核酸序列與CVA16病毒基因相似度大于等于90%時，提取的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，

當(dāng)所測得的核酸序列與CVA16病毒基因相似度小于90%時，重復(fù)步驟（4）和步驟（5），直至提取的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品；

（6）檢測標(biāo)準(zhǔn)品的OD260值n；

（7）利用（式1）計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品濃度C（copies/μL）：

C=n×50×10-9(2962+m)×2×330×6.02×1023]]>（式1）

式1中：

2962為pMD19-T載體的長度，bp；

1OD260=50μg/mL的雙鏈DNA；

330為1堿基的分子量，g/mol；

6.02×1023為阿伏伽德羅常數(shù)，NA；

步驟四，定量檢測

（1）將步驟三得到的標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋至多個濃度梯度；利用實(shí)時熒光定量PCR分別檢測各濃度梯度樣品的Ct值和初始模版量x（copies），接著利用測得的七組Ct-x進(jìn)行線性回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：

Ct＝alogx+b（式2）

（式2）中：a和b為標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的系數(shù)；

（2）采用實(shí)時熒光定量PCR檢測步驟一所獲得的cDNA的Ct值：Ct0；

（3）將Ct0代入（式2）計(jì)算待檢測水樣中CVA16病毒的初始模板量x0；待檢測水樣中CVA16病毒的含量C1（copies/mL）為：

C1=x0(20/2)(60/5)(1000/140)V]]>（式3）。

上述步驟三的（6）步驟中采用微量紫外分光光度計(jì)法檢測標(biāo)準(zhǔn)品的OD260值。

上述步驟四的（1）步驟中將步驟三得到的標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋至c×10-4copies/μL、c×10-5copies/μL、c×10-6copies/μL、c×10-7copies/μL、c×10-8copies/μL、c×10-9copies/μL和c×10-10copies/μL七個濃度梯度。

上述步驟四的（2）步驟中采用實(shí)時熒光定量PCR檢測cDNA的Ct值，具體過程如下：將12.5μL的2×SYBRMix、400nM的上游引物CVA16-F2、400nM的下游引物CVA16-R和2μL步驟一所獲得的cDNA混合，接著用無菌超純水補(bǔ)足至25μL，在實(shí)時定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，同時以無菌超純水作為陰性對照；其中的PCR反應(yīng)條件為：

①95℃預(yù)變性1min；

②擴(kuò)增循環(huán)40次，每次循環(huán)的反應(yīng)條件依次為：95℃，30s、58℃，30s、72℃，60s、80.5℃，15s；其中80.5℃為讀板溫度；

③從65℃以0.5℃/s的速率升溫至95℃，在此期間每上升0.5℃讀板一次，進(jìn)行熔解曲線測定。

該方法采用半巢式RT-PCR和實(shí)時熒光定量RT-PCR方法對環(huán)境水體中的CVA16病毒含量進(jìn)行檢測，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法具有如下的技術(shù)有點(diǎn)：

（1）方法中所設(shè)計(jì)的引物特異性高，與環(huán)境中常見的其他病原微生物沒有交叉反應(yīng)；

（2）靈敏度高，在環(huán)境樣品中，常規(guī)PCR的電泳結(jié)果呈現(xiàn)陰性結(jié)果，在半巢式第二輪PCR中，某些樣品成陽性結(jié)果。半巢式PCR大幅度提高了常規(guī)PCR檢測的靈敏度；

（3）定性結(jié)果準(zhǔn)確，并可獲得陽性樣品中CVA16核酸序列，有助于更深一步基因?qū)用娴姆治龊丸b定；

（4）精確定量，本發(fā)明采用由一系列梯度稀釋的重組質(zhì)粒作為模板進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR制得CVA16的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)式2和式3可以對水樣中CVA16的含量檢測；

（5）檢測范圍寬廣，本方法當(dāng)CVA16模板量在1.190×100copies/μL～1.190×109copies/μL范圍內(nèi)，模板量對數(shù)值與CT之間具有良好的線性關(guān)系；

（6）精密度高，樣品CT值的組內(nèi)變異系數(shù)均低于1.5%，組間變異系數(shù)均低于3%，故本方法具有較高的精密度。

附圖說明

圖1為實(shí)施例中PCR產(chǎn)物二的電泳圖；

圖2為實(shí)施例中實(shí)時定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖3為實(shí)施例中實(shí)時定量PCR擴(kuò)增曲線圖。

具體實(shí)施方式

發(fā)明人根據(jù)腸道病毒VP1血清分型區(qū)序列的保守片段，設(shè)計(jì)可以特異地擴(kuò)增CVA16的半巢式PCR引物，引物序列如表1所示，經(jīng)BLAST在NCBI基因庫比對分析，與各引物具有高度相似性的序列都來源于其對應(yīng)的CVA16的核酸。

表1引物序列表

a兼并引物堿基:Y=C/T,R=A/G,K=G/T.

b基因庫序列號JQ316639.

以下是發(fā)明人給出的具體實(shí)施例，以對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步解釋說明。

實(shí)施例：

該實(shí)施例中所用設(shè)備和試劑如下：

（1）高速冷凍離心機(jī)，最大轉(zhuǎn)速14000r/min；

（2）4℃、-80℃冰箱

（3）離心管，50mL，1.5mL，0.5mL，0.2mL；

（4）微量紫外分光光度計(jì)；

（5）恒溫金屬加熱器

（6）細(xì)菌搖床、細(xì)菌培養(yǎng)箱

（7）實(shí)時熒光定量PCR儀；

（8）梯度定性PCR儀；

（9）電泳儀；

（10）凝膠成像儀

（11）pMD19-T載體；

（12）感受態(tài)大腸桿菌DH5α：

（13）鹽酸，NaCl溶液，MgCl2溶液等；

（14）分子量6000的聚乙二醇（PEG-6000），葡萄糖等；

（15）5mol/LNaCl溶液；

（16）IPTG/X-gal/Amp平板；

（17）LB液體培養(yǎng)基；

（20）總RNA提取試劑盒；

（18）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒；

（19）dNTPmixture；

（20）10×ExTaqbuffer；

（21）SYBRGreenI實(shí)時熒光定量PCR試劑盒；

（22）質(zhì)粒提取試劑盒；

（22）所用特異性引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

具體檢測方法如下：

步驟一，樣品處理：

（1）病毒濃縮：于50mL的待檢測水樣（采自西安某污水廠原污水，并于4℃條件下保存）中加入質(zhì)量百分比為8%的聚乙二醇和質(zhì)量百分比為2.3%的氯化鈉，接著將待檢測水樣在100rpm、4℃條件下攪拌12小時，然后將待檢測水樣在9000g、4℃條件下離心30分鐘，棄上清液，用1mL超純水重懸沉淀得到病毒濃縮液；

（2）RNA提取：使用RNA提取試劑盒從病毒濃縮液中提取RNA；

（3）逆轉(zhuǎn)錄：將5μL的RNA、2μL的5×gDNAEraserBuffer、1μL的5×gDNAEraserBuffer和2μL的RNaseFreedH2O在42℃條件下反應(yīng)2min得到反應(yīng)液，將該反應(yīng)液與4μL的5×Buffer、1μL的RTEnzymeMix、1μL的RTPrimerMix和4μL的RNaseFreedH2O混合進(jìn)行如下反應(yīng)：先在37℃條件下反應(yīng)15min；接著在85℃條件下反應(yīng)5s，得到cDNA，并將所得cDNA在-80℃條件下保存；

步驟二，定性檢測

（1）將2.5μL的10×ExTaqBuffer、2μL的dNTPMixture、0.25μL的ExTaq、400nM的上游引物CVA16-F1、400nM的下游引物CVA16-R和2μL步驟一所獲得的cDNA混合，接著用無菌超純水補(bǔ)足至25μL，在梯度PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，同時以無菌超純水作為陰性對照；其中的PCR反應(yīng)條件為：①95℃預(yù)變性5min；②擴(kuò)增循環(huán)35次，每輪循環(huán)的反應(yīng)條件為：95℃，30s；56℃，30s；72℃，60s；③在72℃延伸5min，反應(yīng)產(chǎn)物為PCR產(chǎn)物一；

（2）將2.5μL的10×ExTaqBuffer、2μL的dNTPMixture、0.25μL的ExTaq、400nM的上游引物CVA16-F2、400nM的下游引物CVA16-R和0.2μLPCR產(chǎn)物一混合，接著用無菌超純水補(bǔ)足至25μL，在梯度PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，同時以無菌超純水作為陰性對照，其中的PCR反應(yīng)條件為：

①95℃預(yù)變性5min；

②擴(kuò)增循環(huán)35次，每次循環(huán)的反應(yīng)條件為：95℃，30s；58℃，30s；72℃，60s；

③在72℃延伸5min，擴(kuò)增產(chǎn)物為PCR產(chǎn)物二；

（3）將所得的PCR產(chǎn)物二用含體積濃度2%GelRed核酸染料的瓊脂糖凝膠跑電泳，在凝膠成像儀下拍照，如圖1所示，PCR產(chǎn)物二有一個樣品出現(xiàn)目的條帶，將電泳條帶切割膠純化回收，得到膠純化回收產(chǎn)物；

（4）采用雙脫氧終止法所得膠純化回收產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列的測定，將所測得的核苷酸序列在NCBI基因庫經(jīng)BLAST比對，所測得的核酸序列與CVA16病毒基因相似度為96%，故確定待檢測水樣中存在CVA16；繼續(xù)依次進(jìn)行步驟三和步驟四；

步驟三：標(biāo)準(zhǔn)品制備：

（1）第一輪PCR擴(kuò)增：以步驟一獲得的cDNA為模板，以CVA16-F1和CVA16-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到第一輪擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物；

（2）第二輪PCR擴(kuò)增：以第一輪擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物為模板，以CVA16-F2和CVA16-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到第二輪擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物；

（3）將所得的第二輪擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用含體積濃度為2%的GelRed核酸染料的瓊脂糖凝膠跑電泳，在凝膠成像儀下拍照確認(rèn)目的條帶，；之后切割目的條帶并純化回收，得到目的片段回收產(chǎn)物，目的片段回收產(chǎn)物長度為m=170bp；

（4）將目的片段回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，采用藍(lán)白斑篩選法篩選出連接轉(zhuǎn)化的菌落，將該菌在含有抗生素卡那霉素（Amp）的LB液體培養(yǎng)基中于37℃條件下培養(yǎng)12～16小時得到菌液，接著用質(zhì)粒提取試劑盒從菌液中提取質(zhì)粒；

（5）采用雙脫氧終止法對得到的質(zhì)粒的核苷酸序列進(jìn)行測定，將所測得的核苷酸序列在NCBI基因庫經(jīng)BLAST比對，所測得的核苷酸序列與CVA16病毒基因相似度大于90%，提取的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品；

（6）采用微量紫外分光光度計(jì)測得標(biāo)準(zhǔn)品的OD260值為n=1.312；

（7）利用（式1）計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品濃度C=1.910×1010copies/μL；

步驟四，定量檢測

（1）將標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋至1.910×106copies/μL、1.910×105copies/μL、1.910×104copies/μL、1.910×103copies/μL、1.910×102copies/μL、1.910×101copies/μL和1.910×100copies/μL七個濃度梯度，利用實(shí)時熒光定量PCR分別檢測各濃度梯度樣品的Ct值和初始模版量x（copies），即不同初始模板量x（copies）的Ct值，接著利用測得的七組Ct-x{（3.820×106，17.221）、（3.820×105，20.882）、（3.820×104，24.363）、（3.820×103，27.536）、（3.820×102，31.238）、（3.820×101，33.841）、（3.820×100，37.679）}，進(jìn)行線性回歸分析，得到圖2所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線和圖3的擴(kuò)增曲線，且擴(kuò)增效率為98.3%，線性回歸系數(shù)為0.997，該標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

Ct=-3.363logx+39.584（式4）

（2）檢測步驟一所得的cDNA的Ct值：將12.5μL的2×SYBRMix、400nM的上游引物CVA16-F2、400nM的下游引物CVA16-R和2μL步驟一所獲得的cDNA混合，接著用無菌超純水補(bǔ)足至25μL，在實(shí)時定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，同時以無菌超純水作為陰性對照；其中的PCR反應(yīng)條件為：

①95℃預(yù)變性1min；

②擴(kuò)增循環(huán)40次：每次循環(huán)的反應(yīng)條件為：95℃，30s；58℃，30s；72℃，60s；80.5℃，15s；其中80.5℃為讀板溫度；

③從65℃以0.5℃/s的速率升溫至95℃，在此期間每上升0.5℃讀板一次，進(jìn)行熔解曲線測定；

測得Ct值Ct0：為36.241；

（3）將Ct0代入（式4）計(jì)算待檢測水樣中CVA16的初始模板量x0為9.863×100copies，利用（式3）求得待檢測水樣中CVA16病毒的含量C1（copies/mL）為1.691×102copies/mL。

發(fā)明人對本技術(shù)中的定量PCR檢測方法的精密度進(jìn)行了驗(yàn)證，選取已知濃度樣品的cDNA（標(biāo)準(zhǔn)品），在同一批次內(nèi)進(jìn)行6次實(shí)時熒光定量PCR檢測，計(jì)算Ct值的組內(nèi)變異系數(shù)；然后分6批對所選樣品進(jìn)行6次檢測，計(jì)算Ct的組間變異系數(shù)。表2為檢測的組內(nèi)變異系數(shù)和組間變異系數(shù)，樣品Ct值的組內(nèi)變異系數(shù)均低于1.5%，組間變異系數(shù)均低于3%，表明本方法具有較高的精密度。

表2定量PCR檢測方法的組內(nèi)和組間變異系數(shù)