技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基質(zhì)金屬蛋白酶-2多肽及其應(yīng)用，具體涉及具有抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2、具有減輕急性炎癥反應(yīng)對機體破壞的多肽。

背景技術(shù)：

膿毒血癥(sepsis)一直是一個嚴重的醫(yī)學(xué)問題。早期膿毒血癥不經(jīng)過及時有效治療可進展為重癥膿毒血癥和膿毒血癥性休克，兩者死亡率分別為20%～30%和40%～70%。醫(yī)學(xué)界一直在研究有效的治療手段，如早期對癥治療、激活蛋白C、皮質(zhì)激素治療等。近年來隨著醫(yī)學(xué)研究的深入，對膿毒血癥的認識和治療取得了很大進展。其中，基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)在內(nèi)毒素休克中扮演著重要角色。

基質(zhì)金屬蛋白酶是一組由20幾種結(jié)構(gòu)相似和功能相關(guān)的蛋白內(nèi)切酶組成。它們可以發(fā)揮正常的生理功能，例如卵細胞著床，骨骼生長和器官發(fā)育等；這些酶還可以在諸如炎癥，傷口愈合和腫瘤細胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮病理作用。基質(zhì)金屬蛋白酶被更多的看作是這些病理過程的調(diào)節(jié)因子。在基質(zhì)金屬蛋白酶家族中，MMP－2和MMP－9，是MMP家族的重要成員，分別編碼72kDa和92kDa的明膠酶A和明膠酶B。正常穩(wěn)定狀態(tài)下，組織較少合成、分泌MMP－2，在炎癥、腸化、增生和損傷等刺激下，細胞內(nèi)部調(diào)控平衡機制紊亂，合成、分泌MMP－2增多。

中性粒細胞是循環(huán)系統(tǒng)中最豐富的白細胞，在機體受到細菌感染時，中性粒細胞可迅速作出反應(yīng)，首先進入被感染部位，構(gòu)成了機體免疫系統(tǒng)應(yīng)對細菌感染的第一道防線。中性粒細胞的細胞顆粒中儲存有不同種預(yù)先產(chǎn)生的酶類，包括彈性蛋白酶（elastase），基質(zhì)金屬蛋白酶-8（MMP-8）和基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）等?；|(zhì)金屬蛋白酶-8可切割膠原蛋白（collagen），基質(zhì)金屬蛋白酶-2可繼續(xù)把變性的膠原蛋白或明膠切割成更小的片段?；|(zhì)金屬蛋白酶-2本身也有切割Ⅳ型膠原蛋白的活力，Ⅳ型膠原蛋白是血管基底層的主要成分。與其它細胞不同，中性粒細胞不表達基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）。這使得中性粒細胞在受到諸如LPS，IL-8和PMA等的刺激時，迅速釋放胞內(nèi)顆粒，而釋放的基質(zhì)金屬蛋白酶類可被同時釋放的有氧自由基激活，在局部具有較高的濃度。這些酶除了具有正常的殺菌功能外，在病理條件下可能會對機體造成很大的破壞。內(nèi)毒素模型就是一個很好的例子，在高劑量靜脈注射LPS后（8mg/kg小鼠），小鼠循環(huán)系統(tǒng)中的中性粒細胞可迅速釋放胞內(nèi)顆粒的內(nèi)容物，血液中的基質(zhì)金屬蛋白酶-2的濃度在30分鐘時就可以達到峰值，其酶活力可以發(fā)揮諸如破壞血管基底層等作用，并推進了休克癥狀的發(fā)展。這一點可由基質(zhì)金屬蛋白酶-2缺失（knockout）小鼠對內(nèi)毒素休克的抑制作用證明。所以，基質(zhì)金屬蛋白酶-2可以作為以中性粒細胞為主的炎癥反應(yīng)的主要靶點。

基質(zhì)金屬蛋白酶-2的抑制劑包括大分子和小分子。大分子抑制劑的制備和使用限制了它們的發(fā)展，例如重組人金屬基質(zhì)蛋白酶組織抑制因子-3的體內(nèi)半衰期只有4分鐘。很多成功的小分子抑制劑，例如Marimastat，可以在納摩爾水平上抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活力，但小分子抑制劑缺乏特異性，如果在慢性疾病中長期使用缺乏特異性的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑可產(chǎn)生副作用。因而，從基質(zhì)金屬蛋白酶酶抑制劑的應(yīng)用角度來看，以急性炎癥反應(yīng)作為研究對象是正確的選擇。在急性反應(yīng)期，機體能夠耐受短期的、金屬介質(zhì)蛋白酶-2廣譜抑制劑對正常生理功能的抑制，同時使關(guān)鍵組織器官的生理結(jié)構(gòu)免受破壞，增加了生存幾率。

通過化學(xué)方法合成了多肽抑制劑。這條多肽抑制劑可以選擇性的抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-8，基質(zhì)金屬蛋白酶-2和腫瘤壞死因子釋放酶的活力，在用內(nèi)毒素模型檢測多肽抑制劑體內(nèi)活力的實驗中，多肽抑制劑能夠使小鼠避過了注射LPS后血液中基質(zhì)金屬蛋白酶-2的高峰期（30分鐘血液濃度達到峰值）并抑制了腫瘤壞死因子（TNF-α）的釋放（1小時時血液濃度達到峰值），從而有效的保護了小鼠，度過了急性炎癥反應(yīng)期，增加了小鼠的生存率。

目前，國際上開發(fā)出的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑已進入Ⅱ期臨床（多發(fā)性硬化癥，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等）和三期臨床（牙周炎等）。本專利中的多肽抑制劑已證明在急性炎癥反應(yīng)中有效，具有在其他炎癥模型中開發(fā)的前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的

本發(fā)明提供全新的序列，該序列基質(zhì)金屬蛋白酶-2抑制劑，對急性炎癥具有很好的療效。

技術(shù)方案

基質(zhì)金屬蛋白酶-2多肽抑制劑3，其特征在于其序列為Trp-Ser-Asn-Val-Gly-Gly-Gly-Gly-Glu-Lys-Met。

基質(zhì)金屬蛋白酶-2多肽抑制劑3在制備治療抑制急性炎癥藥物中的應(yīng)用。

有益效果

利用固相合成法化學(xué)合成基質(zhì)金屬蛋白酶-2多肽抑制劑3，該多肽具有全新的序列，該多肽可體外抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2，-8，-3和腫瘤壞死因子釋放酶的酶活力。在內(nèi)毒素休克模型實驗中成功的增加了小鼠的生存率。在急性炎癥反應(yīng)中，中性粒細胞釋放大量酶和有氧離子，其中包括基質(zhì)金屬蛋白酶-8和基質(zhì)金屬蛋白酶-2，這些酶可以切割并破壞機體組織，造成損傷；單核巨噬細胞表達腫瘤壞死因子釋放酶，這種酶可切割并釋放腫瘤壞死因子，腫瘤壞死因子是炎癥反應(yīng)的核心細胞因子，有加重炎癥反應(yīng)的作用。我們發(fā)現(xiàn)的多肽抑制劑可以同時抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2，-8和腫瘤壞死因子釋放酶的酶活力，從而減輕了炎癥反應(yīng)，保護機體并減輕炎癥的破壞作用。

附圖說明

附圖1多肽抑制劑分子構(gòu)像示意圖。1.色氨酸Trp，2.絲氨酸Ser，3.天冬酰氨Asn，4.纈氨酸Val，5.甘氨酸Gly，6.甘氨酸Gly，7.甘氨酸Gly，8.甘氨酸Gly，9.谷氨酸Glu，10.亮氨酸Lys，11.甲硫氨酸Met。

具體實施方式

實施例1

多肽的化學(xué)合成方法

多肽用Fmoc化學(xué)方法合成。合成反應(yīng)從C端向N端進行，Rink介質(zhì)（可在AdvancedChemTech公司購得）上有自由氨基，順序連接Met，Lys，Glu，Gly，Gly，Gly，Gly，Val，Asn，Ser和Trp。每一步連接過程中，氨基酸殘基都要活化，活化混合物中有4倍于介質(zhì)上自由氨基的HBTU，HOBt，DIEA和Fmoc-氨基酸。每次氨基酸的連接反應(yīng)之后，都用一個吡啶/醋酸/N-甲基咪唑（4:1:0.5）的混合物來封閉未連接的自由氨基，封閉反應(yīng)10min。每次氨基酸的連接反應(yīng)之后，下一個氨基酸連接之前，都要把介質(zhì)上的Fmoc-基團去掉，去Fmoc-基團使用含20%哌啶的二甲基甲酰胺，需15分鐘。最后，當所有氨基酸殘基順序連接之后，多肽用98%三氟乙酸從介質(zhì)上切割下來，切割在室溫下進行2小時。

應(yīng)用上述化學(xué)條件可合成并獲得多肽，序列為Trp-Ser-Asn-Val-Gly-Gly-Gly-Gly-Glu-Lys-Met，該序列為全新序列。

也可委托上海生工合成。

實施例2

多肽抑制劑體外對幾種靶點酶：基質(zhì)金屬蛋白酶-3，-8，-2及腫瘤壞死因子釋放酶(均購于sigma公司)的IC50值。

重組人基質(zhì)金屬蛋白酶-2由E.coli細胞表達。該酶用0.01μM的基質(zhì)金屬蛋白酶-3活性位點活化，所用的緩沖液為100mMTris/HCl，pH7.4，100mMNaCl，10mMCaCl2and0.01%Tween-20?；罨瘯r基質(zhì)金屬蛋白酶-2的濃度為72ng/μl(1μM)。酶活力的檢測是通過切割熒光產(chǎn)生多肽底物Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2并檢測產(chǎn)生的熒光值實現(xiàn)的(激發(fā)波長=328nm，檢測波長=392nm)。所有的檢測在37°C下100μl反應(yīng)體系中進行。測得的IC50值為46.32μmol。

重組人基質(zhì)金屬蛋白酶-8的檢測與-2的檢測類似并使用同樣的熒光產(chǎn)生底物。反應(yīng)也是在37°C下100μl反應(yīng)體系中進行。檢測時向反應(yīng)體系中加20μl重組人基質(zhì)金屬蛋白酶-8(2ng/μl)。底物的終濃度為10μM。測得的IC50值為14.78μmol。

重組人基質(zhì)金屬蛋白酶-3用另外一個熒光產(chǎn)生底物Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nval-Trp-Arg-Lys(Dnp)-NH2來檢測(激發(fā)波長=320nm，發(fā)射波長=405nm)。反應(yīng)在37°C下100μl反應(yīng)體系中進行。反應(yīng)開始時向反應(yīng)體系中加10μl基質(zhì)金屬蛋白酶-3存儲液(1ng/μl)底物的終濃度為10μM。測得的IC50值為33.66μmol。

腫瘤壞死因子釋放酶的活力是通過切割熒光產(chǎn)生底物Mca-Pro-Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Dpa-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-NH檢測的(激發(fā)波長=320nm，發(fā)射波長=405nm)。反應(yīng)在37°C下100μl反應(yīng)體系中進行。反應(yīng)開始時向反應(yīng)體系中加4μl基質(zhì)金屬蛋白酶-3存儲液(1ng/μl)底物的終濃度為10μM。測得的IC50值為67.30μmol。

實施例3

用內(nèi)毒素休克模型檢測多肽抑制劑的體內(nèi)活力

在建立內(nèi)毒素休克模型之前，我們首先測定了LPS（E.coli0111：B4）小白鼠的LD50為50μg每只小鼠，在實驗中我們采用了100μg每只小鼠，這樣，對照組的小鼠可全部死亡。用Regasepin2做了一個陽性對照實驗。對照組小鼠注射100μgLPS，而Regasepin2實驗組的小鼠在注射LPS5分鐘之后，每只小鼠再注射0.7mg的多肽。通過制作Kaplan-Meier生存曲線發(fā)現(xiàn)Regasepin2可有效的保護注射了100μg的小鼠，提高了生存率。成功地在小白鼠上建立內(nèi)毒素休克模型之后，用該模型檢測Trp-Ser-Asn-Val-Gly-Gly-Gly-Gly-Glu-Lys-Met的體內(nèi)活力。對照組小鼠（12只）注射100μgLPS，而多肽抑制劑組小鼠（12只）在注射LPS5min后，每只小鼠注射0.7mg多肽抑制劑。用Kaplan-Meier生存曲線分析，多肽Trp-Ser-Asn-Val-Gly-Gly-Gly-Gly-Glu-Lys-Met可有效地保護小白鼠，提高內(nèi)毒素休克小鼠的生存率。這些數(shù)據(jù)表明，抑制MMP-2和TACE活力可有效提高內(nèi)毒素休克小鼠的生存率。

SEQUENCELISTING

<110>蘇州普羅達生物科技有限公司

<120>基質(zhì)金屬蛋白酶-2多肽抑制劑3及其應(yīng)用

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<213>人工序列

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