技術領域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學材料領域，涉及具有多重氧化還原刺激響應特性的納米粒子基因載體。

背景技術：

在治療遺傳性疾病以及腫瘤方面，病毒雖然是目前最有效的基因載體，但是其不可忽視的安全隱患限制了病毒載體的臨床應用。大多數(shù)病毒是由壓縮基因組的內核和包被的蛋白質殼層所組成的具有核殼結構的納米尺度顆粒。病毒在細胞外穩(wěn)定存在，其可以識別細胞所提供的信號，并依據(jù)的體內或細胞微環(huán)境的變化而進行逐步的分子轉化從而啟動解組裝響應的特點為非病毒基因載體的設計提供了很好的啟迪。人們也設計出模擬病毒解組裝響應的核殼型“人造病毒”，如特定的酶、酸堿度或還原環(huán)境而引起單一式響應的殼的去遮蔽或核的解壓縮過程。雙響應式設計也證明，同時具備“殼的去遮蔽”和“核的解壓縮”的“人造病毒”更為敏感，但它們都沒有真正模仿到病毒的程序性響應的去遮蔽和解壓縮過程。

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中的還原劑如谷胱甘肽（GSH）的水平比正常組織（1～5微摩爾/升）的高4倍左右，達到約20微摩爾/升的水平（CancerResearch.2002;62:307-12.）；細胞內的還原劑總濃度更高，相當于正常組織的1000倍，達到了1～10毫摩爾/升的水平（AdvDrugDeliverRev.2003;55:199-215.）。針對這些不同組織不同部位的不同氧化還原環(huán)境，設計多重刺激響應的擬病毒基因載體，可以智能化的控制基因的釋放表達和對于腫瘤細胞的靶向殺傷性。

分子量為25kDa的聚乙烯亞胺(PEI)是非病毒類載體中被廣泛地作為黃金基準的聚合物載體，但是PEI固有的細胞毒性和很高的表面正電荷，限制其在體內的應用。分子量為800Da的OEI，雖然幾乎沒有細胞毒性，但不能很好壓縮DNA，轉染效率較低。

因此，開發(fā)出具有良好穩(wěn)定性并能生物降解為無毒安全小分子的載體，又同時具有氧化還原等多重刺激響應性的，且具有較高轉染效率的基因載體是行業(yè)亟需解決的技術問題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要提供的是具有梯度氧化還原刺激響應性的三元復合物納米粒子基因載體及其制備方法，并將其用于體外基因轉染、腫瘤、哮喘和心血管疾病的基因治療。

本發(fā)明通過以下技術方案來實現(xiàn)：

基因載體系統(tǒng)，由遮蔽體系、陽離子材料和質粒DNA組成，所述遮蔽體系和陽離子材料中都含有氧化還原敏感鍵，構成具有多重氧化還原刺激響應特性的納米粒子基因載體，所述陽離子材料和質粒DNA復合形成二元復合物顆粒，所述遮蔽體系通過靜電作用遮蔽到所述二元復合物表面，形成三元復合物顆粒。采用多重氧化還原刺激響應的策略，更接近病毒載體的去遮蔽和解壓縮過程，可以提高基因輸送的效率，并遠優(yōu)于單一式響應。

作為優(yōu)選方式，所述氧化還原敏感鍵為雙硫鍵或雙硒鍵中的至少一種，使得材料在氧化還原條件下會發(fā)生降解。所述遮蔽體系和陽離子材料中可以都含有雙硫鍵或都含有雙硒鍵，也可以一個含雙硫鍵，另一個含雙硒鍵，還可以各自都同時含有雙硫鍵和雙硒鍵。

作為優(yōu)選方式，所述遮蔽體系中含有雙硫鍵，所述陽離子材料中含有雙硒鍵。這種結構的基因載體系統(tǒng)能夠在腫瘤的細胞外和細胞內不同還原劑濃度的條件下，通過分子化學結構的變化作出實時響應，實現(xiàn)梯度氧化還原刺激響應?？梢允沟萌獜秃衔镙d體在細胞外低GSH濃度的環(huán)境中保持穩(wěn)定，長時間循環(huán)，并保護DNA免受血清中的脫氧核糖核酸酶(DNase)降解；到達目標腫瘤組織時，由于腫瘤組織稍高的GSH濃度，導致外層（遮蔽體中）更為敏感的雙硫鍵首先斷開（或部分斷開），更有利于復合物顆粒的內吞；進入細胞后，胞內GSH濃度比胞外高至1000倍達到1～10毫摩爾/升，此時，較為穩(wěn)定的雙硒鍵（陽離子材料中）也斷開，陽離子材料降解，釋放出DNA，有利于DNA入核，從而實現(xiàn)基因的高表達。

作為優(yōu)選方式，所述遮蔽體系中含有雙硒鍵。這種結構的基因載體能更好的保護DNA，使其免受血清中的（脫氧核糖核酸酶）DNase降解，以及避免血清中負電荷的血清蛋白造成的聚沉現(xiàn)象而形成血栓。外層（遮蔽體中）采用相對更穩(wěn)定的雙硒鍵，使得三元復合物載體在細胞外低GSH濃度的環(huán)境中更穩(wěn)定，循環(huán)時間更長，到達目標腫瘤組織時，在腫瘤組織稍高的GSH濃度下仍然需要接觸更長的時間或直到進入細胞后才會斷開，進入細胞后，整個三元復合物體系徹底解組裝，從而釋放出DNA，實現(xiàn)基因轉染。還可以與外層含雙硫鍵的載體混合使用，已到達更好的綜合效果。

作為優(yōu)選方式，所述遮蔽體系為對糖胺聚糖上的至少一個葡萄糖醛酸單元上的羧基進行修飾，得到的具有還原敏感的雙硫鍵或雙硒鍵并且末端仍是羧基的糖胺聚糖衍生物。糖胺聚糖（glycosaminoglycan），為雜多糖的一種，糖胺聚糖分為：透明質酸、4-硫酸軟骨素、6-硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素、肝素和硫酸角質素等。它是由重復的二糖單位構成的長鏈多糖，其二糖單位之一是氨基己糖（氨基葡萄糖或氨基半乳糖），故稱糖胺聚糖；另一個是糖醛酸。糖胺聚糖是細胞間質的重要組成部分，細胞間質絕大部分都是糖胺聚糖，因此具有良好的生物相容性和可降解性。

作為一種優(yōu)選，本發(fā)明中所述遮蔽體系中所用的糖胺聚糖的分子量為5-2000kDa。

作為一種優(yōu)選，本發(fā)明中所述糖胺聚糖為透明質酸。

作為一種優(yōu)選，所述遮蔽體系為通過對透明質酸上的至少一個葡萄糖醛酸單元上的羧基進行修飾，得到的具有還原敏感的雙硫鍵并且末端仍是羧基的透明質酸衍生物（HA-SS-COOH）。結構示意如下：

作為優(yōu)選方式，所述陽離子材料由含雙硫鍵或雙硒鍵的化合物與聚乙烯亞胺、聚丙烯亞胺、精胺、氨基酸多肽、肽類樹狀分子或含肽類樹狀分子的陽離子脂質材料或其他脂質材料（如陽離子脂質聚合物等）中的至少一種交聯(lián)而成。所述陽離子材料的外圍都含有豐富的氨基，便于與含雙硫鍵或雙硒鍵的化合物交聯(lián)，所述含雙硫鍵或雙硒鍵的化合物為含雙硫鍵或雙硒鍵的二羧酸或二烯。所述聚乙烯亞胺、聚丙烯亞胺、精胺、氨基酸多肽或脂質材料的分子量為200～4000Da。

作為優(yōu)選方式，所述由含雙硫鍵或雙硒鍵的化合物與聚乙烯亞胺或聚丙烯亞胺或精胺交聯(lián)而成陽離子材料結構式為：

或

其中，n=1~10，x≥1，y≥1，DT為聚乙烯亞胺或聚丙烯亞胺或精胺。所述陽離子材料細胞毒性低，轉染效率高，分子量可控。

作為優(yōu)選方式，所述陽離子材料為雙硒鍵交聯(lián)的寡聚乙烯亞胺(OEI-SeSex)，結構示意如下：

其中n=1～10，x≥1。

作為一種優(yōu)選，所述含肽類樹狀分子的陽離子脂質材料結構式為：

其中，R1為飽和/不飽和烴基或氨基酸基團，R2為氨基酸基團、飽和/不飽和烴基或，R1和R2中至少一個為氨基酸基團，X、Y、Z為NH、O或S，o、p、q分別獨立為1或0；所述飽和/不飽和烴基優(yōu)選烷基、烯基、芳香基，更優(yōu)選為C10-C20的烷基、的烯基、含芳香基的氨基酸衍生物，所述氨基酸基團優(yōu)選為賴氨酸、精氨酸或組氨酸基團。

作為一種優(yōu)選，所述含肽類樹狀分子的陽離子脂質材料結構式為：

或

作為一種優(yōu)選，本發(fā)明所述基因載體系統(tǒng)中所述的質粒DNA采用在真核細胞表達的質粒DNA。可以是含報告基因或細胞因子基因或抑癌基因的真核重組表達質粒。

作為一種優(yōu)選，本發(fā)明所述基因載體系統(tǒng)中遮蔽體系與質粒DNA的質量比例為0.1：1～50：1，陽離子材料與質粒DNA的質量比例為0.1：1～50：1。

本發(fā)明還提供了制備上述基因載體系統(tǒng)的方法，其具體步驟如下：

將質粒DNA溶于無菌HBG緩沖液（4-羥乙基哌嗪乙磺酸20毫摩爾，5%葡萄糖）中，配制成濃度為0.1mg/mL的DNA溶液；將陽離子材料溶于HBG緩沖液中，配制成濃度為0.1-10mg/mL的溶液A；將遮蔽體系溶于HBG緩沖液中，配制成濃度為0.01-1mg/mL的溶液B;

將上述步驟中得到的溶液A與DNA溶液混合，在室溫下孵育20分鐘后，得到二元復合物，再加入溶液B，在室溫下孵育20分鐘后，得到三元復合物。

本發(fā)明還提供了上述基因載體系統(tǒng)的應用：將所述基因載體與超順磁性納米粒子（MNP）和/或脂溶性的藥物聯(lián)合制成復合載體或藥物，用于體外基因轉染、腫瘤、哮喘或心血管疾病的基因治療、基因與化學藥物療聯(lián)合治療、疾病診療一體化。

本發(fā)明還提供了由基因載體與磁性納米粒子聯(lián)合的復合載體系統(tǒng)，所述磁性納米粒子可以是水溶性的也可以是脂溶性的。作為優(yōu)選，所述磁性納米粒子和基因彌散地分布于所述基因載體中。作為優(yōu)選，所述磁性納米粒子為四氧化三鐵，伽馬三氧化二鐵或摻有錳、鈷或鋅的鐵氧磁性納米粒子中的至少一種。作為優(yōu)選，所述磁性納米粒子為負電性的，其平均粒徑尺度在5~50nm之間,其表面電位在-5~-50mV之間。作為優(yōu)選，所述磁性納米粒子表面修飾有負電性有機材料，所述負電性有機材料可以是羧基硅烷偶聯(lián)劑、氨基酸類樹狀分子、酒石酸、檸檬酸、草酸、乙酸中的至少一種。通過加入磁性納米粒子使復合載體能響應外加磁場，并在外加磁場的引導下集中到目標部位，實現(xiàn)磁靶向功能。

本發(fā)明還提供了一種復合藥物，包括所述基因載體和藥物有效成分。所述藥物可以與所述質粒DNA一起包裹在所述陽離子材料，實現(xiàn)質粒DNA與藥物同時釋放，同時達到基因治療和藥物治療的目的；所述藥物也可以包裹在所述遮蔽體系中或同時包裹在遮蔽體系和陽離子材料中，實現(xiàn)藥物與DNA的分階段釋放。

本發(fā)明還提供了所述基因載體與藥物和磁性納米粒子三者同時復合的復合載體系統(tǒng)。將三者的功能集成在一個載體系統(tǒng)中。

本發(fā)明中所述優(yōu)選方式之間可以任意組合。

本發(fā)明的有益效果：

1.本發(fā)明所述具有多重氧化還原刺激響應性的基因載體，采用多重氧化還原刺激響應的策略，更接近病毒載體的去遮蔽和解壓縮過程，其基因轉染效率明顯優(yōu)于其他單一式刺激響應或非智能響應的傳統(tǒng)基因載體。

2.本發(fā)明所述含有雙硒鍵的氧化還原刺激響應陽離子材料（如OEI-SeSex），能與質粒DNA通過靜電作用形成表面帶有正電荷的納米尺度的二元復合物顆粒（OEI-SeSex/DNAbinarypolyplexes,簡寫為DSe）。本發(fā)明所述含有雙硫鍵的氧化還原刺激響應遮蔽體系（如HA-SS-COOH），其末端的羧基可通過靜電絡合作用與DSe表面剩余的正電荷結合，形成表面具有很低正電荷或是負電荷的三元復合物（OEI-SeSex/DNA/HA-SS-COOHternarypolyplexes,簡寫為DSeS）。

3.本發(fā)明所述含有雙硫鍵的氧化還原刺激響應遮蔽體系，一方面可以達到屏蔽正電荷的作用，降低毒性及避免血清白蛋白引起的聚集，逃脫網狀內皮系統(tǒng)的清除作用，從而減少陽離子聚合物的細胞毒性、增加血清穩(wěn)定性；另一方面，在到達腫瘤組織部位或進入細胞后，在還原性環(huán)境的作用下，更敏感的雙硫鍵會發(fā)生斷裂，解除屏蔽作用，使內部的DSe暴露出來，提高其從內涵體逃逸的能力，從而有利于提高轉染效率。

4.本發(fā)明所述基因載體系統(tǒng)在腫瘤的細胞外和細胞內不同還原劑濃度的條件下，通過分子化學結構的變化作出實時響應。梯度氧化還原刺激響應性可以使得OEI-SeSex/DNA/HA-SS-COOH三元復合物載體在細胞外低GSH濃度的環(huán)境中保持穩(wěn)定，長時間循環(huán)，并保護DNA免受血清中的DNase降解；到達目標腫瘤組織時，由于腫瘤組織稍高的GSH濃度，導致外層更為敏感的雙硫鍵首先斷開（或部分斷開），更有利于復合物顆粒的內吞；進入細胞后，胞內GSH濃度比胞外高至1000倍達到1～10毫摩爾/升，此時，較為穩(wěn)定的雙硒鍵也斷開，降解為低分子量的OEI，釋放出DNA，有利于DNA入核，從而實現(xiàn)基因的高表達。

5.本發(fā)明所述基因載體的制備方法操作簡單、便于大規(guī)模生產。

6.本發(fā)明所述基因載體，能夠很方便地用于體外基因轉染、腫瘤、哮喘和心血管疾病的基因治療。

附圖說明

圖1本發(fā)明所述含有雙硫鍵的氧化還原刺激響應遮蔽體系的結構式。

圖2本發(fā)明所述含有雙硒鍵的氧化還原刺激響應陽離子材料的結構式。

圖3本發(fā)明實施例4所述三元復合物納米粒子基因載體示意圖。

圖4是采用GPC測定的色譜圖。

圖5是不同轉染復合物對HepG2細胞轉染24小時后的細胞存活率。

圖6是不同轉染復合物（DP;DSe;DPS;和DSeS）分別介導綠色熒光蛋白質粒對HepG2細胞轉染效率圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。下列實施例選用透明質酸和聚乙烯亞胺作為示范，本領域技術人員很容易將其推廣到其他材料。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

簡寫說明：

DP：PEI25kDa和DNA的二元復合物，質量比為1.2/1。

DSe：OEI-SeSex和DNA的二元復合物。

DPS：PEI25kDa、DNA和HA-SS-COOH的三元復合物。

DSeS：OEI-SeSex、DNA和HA-SS-COOH的三元復合物。

實施例1：具有雙重氧化還原刺激響應性的基因載體（OEI-SS/DNA/HA-SS-COOH）的制備

將質粒DNA溶于無菌HBG緩沖液（4-羥乙基哌嗪乙磺酸20毫摩爾，5%葡萄糖）中，配制成濃度為0.1mg/mL的DNA溶液；將雙硫鍵交聯(lián)的聚乙烯亞胺（OEI-SS）溶于HBG緩沖液中，配制成濃度為0.1-10mg/mL的OEI-SS溶液；將含有雙硫鍵的遮蔽體系（HA-SS-COOH）溶于HBG緩沖液中，配制成濃度為0.01-1mg/mL的HA-SS-COOH溶液。

將上述OEI-SS溶液溶液和質粒DNA溶液混合，混合后的溶液在室溫下孵育20分鐘后，得到OEI-SS/DNA二元復合物。再加入HA-SS-COOH溶液，所得混合溶液在室溫下孵育20分鐘后，得到遮蔽體系和陽離子材料同時含有雙硫鍵的具有多重氧化還原刺激響應性的基因載體OEI-SS/DNA/HA-SS-COOH三元復合物。

實施例2：具有雙重氧化還原刺激響應性的基因載體（OEI-SeSex/DNA/HA-SeSe-COOH）的制備

將質粒DNA溶于無菌HBG緩沖液（4-羥乙基哌嗪乙磺酸20毫摩爾，5%葡萄糖）中，配制成濃度為0.1mg/mL的DNA溶液；將雙硒鍵交聯(lián)的聚乙烯亞胺（OEI-SeSex）溶于HBG緩沖液中，配制成濃度為0.1-10mg/mL的OEI-SeSex溶液；將含有雙硒鍵的遮蔽體系（HA-SeSe-COOH）溶于HBG緩沖液中，配制成濃度為0.01-1mg/mL的HA-SeSe-COOH溶液。

將上述OEI-SeSex溶液溶液和質粒DNA溶液混合，混合后的溶液在室溫下孵育20分鐘后，得到OEI-SeSex/DNA二元復合物。再加入HA-SeSe-COOH溶液，所得混合溶液在室溫下孵育20分鐘后，得到遮蔽體系和陽離子材料同時含有雙硒鍵的具有多重氧化還原刺激響應性的基因載體OEI-SeSex/DNA/HA-SeSe-COOH三元復合物。

實施例3：具有雙重氧化還原刺激響應性的基因載體（OEI-SeSex/DNA/HA-SS-COOH）的制備

將質粒DNA溶于無菌HBG緩沖液（4-羥乙基哌嗪乙磺酸20毫摩爾，5%葡萄糖）中，配制成濃度為0.1mg/mL的DNA溶液；將雙硒鍵交聯(lián)的聚乙烯亞胺（OEI-SeSex）溶于HBG緩沖液中，配制成濃度為0.1-10mg/mL的OEI-SeSex溶液；將含有雙硫鍵的遮蔽體系（HA-SS-COOH）溶于HBG緩沖液中，配制成濃度為0.01-1mg/mL的HA-SS-COOH溶液。

將上述OEI-SeSex溶液溶液和質粒DNA溶液混合，混合后的溶液在室溫下孵育20分鐘后，得到OEI-SeSex/DNA二元復合物。再加入HA-SS-COOH溶液，所得混合溶液在室溫下孵育20分鐘后，得到具有多重氧化還原刺激響應性的基因載體OEI-SeSex/DNA/HA-SS-COOH三元復合物。

體外基因轉染試驗顯示實施例1-3所述的三種基因載體基因轉染效率均高于只含有一重還原刺激響應性的基因載體。

實施例4：具有梯度氧化還原雙重刺激響應性的基因載體的制備

將質粒DNA溶于無菌HBG緩沖液（4-羥乙基哌嗪乙磺酸20毫摩爾，5%葡萄糖）中，配制成濃度為0.1mg/mL的DNA溶液；將雙硒鍵交聯(lián)的聚乙烯亞胺（OEI-SeSex）溶于HBG緩沖液中，配制成濃度為0.1-10mg/mL的OEI-SeSex溶液；將含有雙硫鍵的遮蔽體系（HA-SS-COOH）溶于HBG緩沖液中，配制成濃度為0.01-1mg/mL的HA-SS-COOH溶液。

將不同濃度的雙硒鍵交聯(lián)的聚乙烯亞胺（OEI-SeSex）溶液和質粒DNA溶液以一定質量比混合，混合后的溶液在室溫下孵育20分鐘后，得到OEI-SeSex/DNA二元復合物。再加入不同濃度的HA-SS-COOH溶液，所得混合溶液在室溫下孵育20分鐘后，得到同時含有雙硫鍵和雙硒鍵具有梯度氧化還原雙重刺激響應性的基因載體OEI-SeSex/DNA/HA-SS-COOH三元復合物。此OEI-SeSex/DNA/HA-SS-COOH三元復合物用于下一步的毒性和轉染等實驗。按照上述方法制備的三元復合物粒子的組成及性能如表1所示。

表1.OEI-SeSex/DNA/HA-SS-COOH三元復合物的組成和性能復合物簡寫陽離子：DNA：HA-SS-COOH的質量比復合物粒徑（nm）復合物表面電荷（mV）DP1.2：1：0111.2523.73DPS1.2：1：2197.526.92DSe0.1：1：0>1μm-16.12DSe10：1：084.3527.07DSe50：1：076.7428.50DSeS10：1：0.189.4325.65DSeS10：1：2164.5015.54DSeS50：1：50>1μm-19.48

實施例5：雙硒鍵的氧化還原刺激響應性能測試

為了驗證雙硒鍵的氧化還原刺激響應性能，將OEI800-SeSex分別用不同濃度GSH（10μm或100μm）處理一定的時間（4h或8h）后，用凝膠滲透色譜法（GPC法）測其分子量，色譜圖見圖4。GPC設備參數(shù)如下：Waters2690DHPLC,ultrahydrogel120及ultrahydrogel1000柱串聯(lián)，折射率檢測器；流動相：0.1摩爾/升的甲酸鈉緩沖液（pH2.8），流速1.0毫升/分，柱溫35°C；以聚乙二醇為標準物質計算分子量。

圖4是采用GPC測定的色譜圖，從下往上分別是：PEI25k是分子量為25kDa的聚乙烯亞胺；OEI800-SeSex是雙硒鍵交聯(lián)的聚乙烯亞胺；OEI800-SeSex經10μmGSH處理4h后；OEI800-SeSex經10μmGSH處理8h后；OEI800-SeSex經100μmGSH處理4h后；OEI800是分子量為800Da的寡聚乙烯亞胺。由圖4可見，本實施例中選用與PEI25k分子量相當?shù)腛EI800-SeSex，經過10μmGSH處理4h或8h后，其分子量均不發(fā)生改變，而當用更高濃度的GSH（100μm）處理4h后，分子量變小至OEI800。說明OEI800-SeSex中的雙硒鍵在10μmGSH環(huán)境下是比較穩(wěn)定的，而在100μm的高濃度下，雙硒鍵會斷開，使OEI800-SeSex降解為小分子的OEI800片段。而文獻報道（AapsJournal.2009；11：445-455），雙硫鍵在10μm水平的還原劑作用下也會隨著時間的延長而斷開。說明在相同10μm水平的還原劑下，雙硒鍵要比雙硫鍵更穩(wěn)定；在更高水平的還原劑下，雙硒鍵和雙硫鍵都會斷開?？梢姡景l(fā)明所述OEI-SeSex/DNA/HA-SS-COOH三元復合物載體具有梯度氧化還原刺激響應性能。

實施例6：細胞存活率檢測

HepG2細胞的培養(yǎng)：取人的肝腫瘤細胞HepG2細胞，在含有10%（質量/體積百分數(shù)）的胎牛血清的培養(yǎng)液中，在含5%（體積百分數(shù)）CO2，溫度為37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。

轉染前24小時內，取對數(shù)生長期HepG2細胞，胰酶消化后用DMEM培養(yǎng)基稀釋，按每孔1X104細胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于含5%（體積百分數(shù)）的CO2，溫度為37℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至80-90%融合，轉染時，吸去前一天加注的細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用PBS洗滌兩次后，加入轉染復合物顆粒和含有10%（質量/體積百分數(shù)）的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基至終體積0.1mL，繼續(xù)培養(yǎng)24小時；

然后加入10μL濃度為5mg/mL的MTT溶液（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽）在37℃孵育4小時，加入150μLDMSO（二甲基亞砜）。然后用酶標儀（Bio-Rad）測試每孔的吸光度值A，測試波長選用492nm。細胞存活率按下公式計算：

細胞存活率（%）=（Asample/Acontrol）X100

Asample是轉染后的細胞樣品孔的吸光度值，Acontrol是不與轉染復合物作用的細胞對照孔的吸光度值，每組實驗重復六次。

圖5是不同轉染復合物對HepG2細胞轉染24小時后的細胞存活率。由圖5可見，雙重刺激響應的DSeS三元復合物對HepG2細胞毒性遠遠低于單一核刺激響應的DSe和單一殼刺激響應的DPS復合物，在HA-SS-COOH/DNA質量比為2，不同的OEI-SeSex/DNA質量比的情況下，DSeS細胞存活率在80%以上，可見本發(fā)明的雙重刺激響應的基因載體具有較低的細胞毒性。

實施例7：具有梯度氧化還原刺激響應的OEI-SeSex/DNA/HA-SS-COOH三元復合物基因載體介導綠色熒光蛋白質粒對HepG2細胞的體外轉染效率的測定

轉染前，取對數(shù)生長期HepG2細胞，胰酶消化后用DMEM培養(yǎng)基稀釋，按每孔4X105細胞的密度接種于6孔培養(yǎng)板，置于含5%（體積百分數(shù)）的CO2，溫度為37℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至80-90%融合，轉染時，吸去前一天加注的細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用PBS洗滌兩次后，加入轉染復合物顆粒以及含有10%（質量/體積百分數(shù)）的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基至終體積2mL，4小時后，更換新鮮的含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)44個小時。

體外轉染效率的測定：取出培養(yǎng)板，用倒置熒光顯微鏡照相；圖6是不同轉染復合物（DP;DSe;DPS;和DSeS）分別介導綠色熒光蛋白質粒對HepG2細胞轉染效率圖。分別顯示了作為基因轉染金標準的DP，單一核氧化還原刺激響應的DSe和單一殼刺激響應的DPS，以及雙重刺激響應的DSeS四種基因載體介導綠色熒光蛋白質粒對HepG2細胞轉染后的熒光照片。

從照片中綠色熒光蛋白表達的情況可見，具有雙重梯度氧化還原刺激響應性能的DSeS基因載體系統(tǒng)，很大程度的提高了綠色熒光蛋白質粒在HepG2細胞中的表達。這是由于具有雙硫鍵的HA-SS-COOH作為遮蔽體系，在粒子進入細胞后，還原響應的雙硫鍵斷裂，幫助遮蔽體系的剝離，使得暴露出OEI-SeSex的正電荷，發(fā)揮其質子泵效應，幫助粒子從內涵體中逃逸出來，進一步雙硒鍵的斷裂可以促進DNA的釋放，進而明顯的提高了基因轉染效率。

實施例8：具有梯度氧化還原刺激響應的OEI-SeSex/DNA/HA-SS-COOH三元復合物基因載體介導熒光素酶質粒對HepG2細胞的體外轉染效率的測定

在6孔板上以4X105細胞/孔接種HepG2細胞，在37℃，5%的CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時左右，轉染時，吸去前一天加注的細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用PBS洗滌兩次后，加入表2中所列的含有熒光素酶DNA的轉染復合物顆粒以及含有10%（質量/體積百分數(shù)）的胎牛血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基至終體積2mL，4小時后，更換新鮮的含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)20個小時。

體外轉染效率的測定：取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌細胞2次，然后加入含1%的TritonX-100的裂解液，使細胞裂解后用Promega公司的熒光素酶檢測試劑盒檢測相對熒光強度，相應的總蛋白量用Thermo公司的BCA試劑盒檢測，最后轉染結果表示為RLU/mgprotein，結果如表2所示。

本發(fā)明利用具有梯度氧化還原刺激響應性能的OEI-SeSex/DNA/HA-SS-COOH（DSeS）三元復合物基因載體，顯著提高基因載體的性能，其對HepG2細胞的轉染效率分別比作為金標準的DP，單一核刺激響應的DSe和單一殼刺激響應的DPS，相應提高了197.2倍，95.4倍及43倍。

表2具有梯度氧化還原刺激響應性能的基因載體系統(tǒng)介導熒光素酶質粒對HepG2的體外轉染效率表復合物編號陽離子：DNA：HA-SS-COOH的質量比轉染效率RLU/mgproteinDP（*）1.2：1：02.096E+7DSe（*）10：1：04.335E+7DPS（*）1.2：1：29.622E+7DSeS0.1：1：23.325E+6DSeS50：1：25.748E+5DSeS10：1：0.11.165E+9DSeS（*）10：1：24.137E+9DSeS10：1：509.918E+4

實施例9：復合載體系統(tǒng)的制備

將質粒DNA溶于無菌HBG緩沖液（4-羥乙基哌嗪乙磺酸20毫摩爾，5%葡萄糖）中，配制成濃度為0.1mg/mL的DNA溶液；將雙硫鍵交聯(lián)的聚乙烯亞胺（OEI-SS）溶于HBG緩沖液中，配制成濃度為0.1-10mg/mL的OEI-SS溶液；將含有雙硫鍵的遮蔽體系（HA-SS-COOH）溶于HBG緩沖液中，配制成濃度為0.01-1mg/mL的HA-SS-COOH溶液。

將上述OEI-SS溶液溶液和質粒DNA溶液混合，同時加入磁性納米粒子，混合后的溶液在室溫下孵育20分鐘后，得到OEI-SS/DNA/MNP三元復合物。再加入HA-SS-COOH溶液（該步驟中還可以再次加入磁性納米粒子），所得混合溶液在室溫下孵育20分鐘后，得到聯(lián)合磁性納米粒子的復合載體。所述復合載體能夠相應外加磁場。

將上述OEI-SS溶液溶液和質粒DNA溶液混合，同時加入藥物，混合后的溶液在室溫下孵育20分鐘后，得到OEI-SS/DNA/藥物三元復合物，再加入HA-SS-COOH溶液（該步驟中還可以再次加入藥物），所得混合溶液在室溫下孵育20分鐘后，得到聯(lián)合藥物的復合載體。

將上述OEI-SS溶液溶液和質粒DNA溶液混合，混合后的溶液在室溫下孵育20分鐘后，得到OEI-SS/DNA二元復合物，再加入HA-SS-COOH溶液，同時加入藥物，所得混合溶液在室溫下孵育20分鐘后，得到另一種聯(lián)合藥物的復合載體。

還可以在所述基因載體的制備過程中既加入磁性納米顆粒又加入藥物，得到同時聯(lián)合MNP和藥物的復合載體。