技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種Ultra-VEGF-trap免疫融合蛋白、其制備方法及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

腫瘤的無限制侵襲性生長及其轉(zhuǎn)移依賴于血管生成。如果沒有新生血管供給營養(yǎng)，腫瘤體積不會(huì)超過2mm3-3mm3。腫瘤血管生長可分為前血管期及血管期。在前血管期，腫瘤細(xì)胞主要依靠彌散方式供養(yǎng)和排泄代謝產(chǎn)物。雖腫瘤細(xì)胞增殖迅速，但增殖與凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡，腫瘤大小一般不超過1-2mm3，可保持?jǐn)?shù)月或數(shù)年不發(fā)生轉(zhuǎn)移。腫瘤一旦轉(zhuǎn)變成血管生成期，腫瘤血管生成因子產(chǎn)生過多，與抑制因子失衡，通過血管生成獲得血液和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，凋亡明顯減少，腫瘤體積迅速增大并發(fā)生轉(zhuǎn)移。此外，近年來發(fā)現(xiàn)腫瘤淋巴管形成對腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移起至關(guān)重要的作用。大量臨床病理研究表明很多實(shí)體瘤早期就已出現(xiàn)癌細(xì)胞至區(qū)域淋巴結(jié)的擴(kuò)散，通過淋巴管轉(zhuǎn)移常常是腫瘤初始轉(zhuǎn)移階段最主要的途徑。腫瘤細(xì)胞進(jìn)人引流淋巴結(jié)，繼而進(jìn)人血流，造成更廣泛的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，威脅患者生命。腫瘤組織中的微淋巴管可為腫瘤細(xì)胞生長提供營養(yǎng)物質(zhì)尤其在轉(zhuǎn)移瘤生長早期，其營養(yǎng)物質(zhì)的提供主要靠彌散方式及微淋巴結(jié)、新生淋巴管通過擴(kuò)張的形式提供，當(dāng)腫瘤生長到1-2mm3時(shí)營養(yǎng)物質(zhì)通過血管的提供才占主要方式。

血管形成(angiogenesis)是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過程，受多種因子的正負(fù)調(diào)控，其中血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是作用最強(qiáng)的正性調(diào)控因子之一，它通過與其特異性受體-血管內(nèi)皮生長因子受體(vascularendothelialgrowthfactorreceptor，VEGFR)結(jié)合刺激新生血管的形成。正常組織內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制因子同時(shí)存在，且保持相對平衡，這種平衡使得人體脈管可以正常地生成和分化。但在腫瘤生長過程中，VEGFs數(shù)量激增，與血管生成抑制因子之間的調(diào)節(jié)失衡，極大地促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞的分裂增殖和遷移，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，提高血管通透性，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供了良好的微環(huán)境。VEGFs是高度保守的同源二聚體糖蛋白，有六個(gè)亞型：VEGF-A，-B，-C，-D，-E，和胎盤生成因子(PLDF)，分子量從35至44kDa不等。其中VEGF-A由于mRNA不同的剪切方式，至少有7種變異體，即VEGF-121、VEGF-145、VEGF-148、VEGF-165、VEGF-183、VEGF-189和VEGF-206。體內(nèi)VEGF-165表達(dá)最高，但VEGF-121血管生長中起主導(dǎo)作用。VEGF-121與VEGF-165為可溶性分泌蛋白，是主要效應(yīng)分子，均以旁分泌形式介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂和增加血管通透性。VEGF-A的表達(dá)與一些實(shí)體瘤的微血管密度具有相關(guān)性，并且組織中VEGF的濃度與乳腺癌、肺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌等實(shí)體瘤的預(yù)后有關(guān)。VEGF-B與VEGF-A有43％的同源性，成熟的VEGF-B蛋白有兩種亞型(VEGF-B167，VEGF-B168)，分別含有167及186個(gè)氨基酸殘基，分子量分別為21kD和32kD。VEGF-B167和VEGF-B186可通過二硫鍵與VEGF-A形成異二聚體(JBiolChem.1995，270(13)：7717-23.)，在人類的各種腫瘤(包括良性與惡性)細(xì)胞中都能檢測出VEGF-BmRNA表達(dá)(SalvenP，etal，AmJPathol，1998，153(1)：103-108)。在創(chuàng)傷或其他損傷組織中，VEGF-B釋放增加并激活。VEGF-B與腫瘤的生長也有密切的關(guān)系，VEGF-B與VEGF-A在局部促進(jìn)血管生長，從而有利于腫瘤的生長。VEGF-C和D為目前已經(jīng)鑒定出的主要的淋巴管生長因子，二者是結(jié)構(gòu)相似的分泌性糖蛋白，是酪氨酸激酶受體VEGFR-3/Flt-4的特異性配體。二者同VEGF-A之間具有同源性。VEGF-C可選擇性地誘導(dǎo)淋巴管的增生，并參與間質(zhì)液的引流、調(diào)節(jié)免疫功能，與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。VEGF-C還有調(diào)節(jié)淋巴內(nèi)皮的獨(dú)特功能，在調(diào)節(jié)其他幾類內(nèi)皮通透性及血管生成方面與VEGF-A有相同的作用。VEGF-C在體內(nèi)具有很強(qiáng)的血管生成作用，且較VEGF-A作用持久，在發(fā)育的胚胎中VEGF-C能促進(jìn)血管進(jìn)行分化生長。內(nèi)皮細(xì)胞VEGF-C可作用于VEGFR-2與VEGFR-3受體，誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細(xì)胞增生。VEGF-D是VEGF家族另一新成員，是在計(jì)算機(jī)進(jìn)行同源搜索時(shí)發(fā)現(xiàn)的，與VEGF-C結(jié)構(gòu)相似。VEGF-D近年來發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)實(shí)體瘤內(nèi)或腫瘤淋巴管生成和或擴(kuò)張，與惡性腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與VEGF-C一起被稱為淋巴管生長因子(KleespiesA，etal.Onkologie.2005，28(5)：281-8.)。胎盤生長因子(PLGF)40％的氨基酸序列和VEGF-A相同，參與病理狀態(tài)下的新生血管和側(cè)支血管的形成。VEGF-E亦屬VEGF家族，是新近在副痘病毒(Orf病毒)基因組現(xiàn)的，能特異性地與VEGFR-2結(jié)合，刺激內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，增加脈管通透性。

各類亞型的VEGF與三種血管內(nèi)皮生長因子受體特異組合相結(jié)合。目前發(fā)現(xiàn)的VEGFR主要有VEGFR-1(fms-liketyrosinekinase，F(xiàn)lt-1)、VEGFR-2(kinaseinsertdomaincontainingreceptor，KDR/Flk-1)和VEGFR-3(Flt-4)，其中VEGFR-1、VEGFR-2與血管的生成關(guān)系密切，VEGF-C/DVEGFR-3則與淋巴管生成密切相關(guān)。VEGFR均屬于酪氨酸激酶受體超家族，在胞外段有7個(gè)免疫球蛋白樣功能區(qū)(immunoglobulin-likedomains)，其中第1-3個(gè)Ig樣區(qū)和VEGF結(jié)合有關(guān)，而兩受體間通過第4個(gè)Ig樣區(qū)形成同源二聚體的活性形式，第5-7個(gè)Ig樣區(qū)在VEGFR1中與激酶活性有關(guān)，在VEGFR2中與肝素協(xié)同作用有關(guān)。與VEGFR-1結(jié)合的是VEGF-A、VEGF-B和PLGF，與VEGF-2結(jié)合的是VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和PLGF，與VEGF3結(jié)合的是VEGF-C、VEGF-D。VEGFR-1和VEGFR-2是目前研究最多的受體，位于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面。VEGFR-1與VEGF有更高的親和力，激活該受體可以促進(jìn)細(xì)胞遷移，但是誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化效應(yīng)不如VEGFR-2(Barleon，B.等，Blood，1996，87，3336-3343；Seetharam，L.，等，Oncogene，1995，10，135-147)。VEGFR-3特異表達(dá)在淋巴內(nèi)皮細(xì)胞表面，在血管內(nèi)皮中基本沒有表達(dá)，與VEGF-C和VEGF-D的結(jié)合后誘導(dǎo)腫瘤淋巴管的增生和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移(NeufeldG等，F(xiàn)ASEBJ.1999，13：9-22)。VEGFs通過與3種酪氨酸激酶受體VEGF-1、VEGF-2和VEGF-3結(jié)合而發(fā)出信號。VEGFR的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑還有諸多爭論。不同的研究者觀察到不同的結(jié)果，但可確信的是Ras-MAPK、PLC-γ-PK以及PI3K等受體酪氨酸激酶信號通路可能都扮演一定的角色，發(fā)揮一定的作用，介導(dǎo)VEGFs的多種生理功能。VEGFs的主要生物學(xué)功能為：(1)選擇性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖并促進(jìn)血管形成；(2)升高血管尤其是微小血管的通透性，使血漿大分子外滲沉積在血管外的基質(zhì)中，為腫瘤細(xì)胞的生長和新生毛細(xì)血管網(wǎng)的建立提供營養(yǎng)；(3)促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移依賴血管生成VEGFs使血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌膠原酶和纖溶酶原，借以降解血管基底膜，同時(shí)，腫瘤組織內(nèi)部新形成的微血管基膜不完善，這種性質(zhì)使腫瘤易于進(jìn)入血循環(huán)；(4)其他作用：VEGFs可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞間隙出現(xiàn)及開窗現(xiàn)象，可活化上皮細(xì)胞的胞質(zhì)小泡及細(xì)胞器。VEGFs直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放蛋白水解酶，降解基質(zhì)，釋放更多的VEGFs，加速腫瘤的發(fā)展，細(xì)胞外蛋白酶又可激活細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合性VEGFs的釋放。VEGFs通過增加血管通透性使血漿蛋白包括纖維蛋白原釋放，形成纖維素網(wǎng)絡(luò)，為腫瘤生長、發(fā)展和轉(zhuǎn)移提供了良好的基質(zhì)。(5)VEGFs可能抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)，促進(jìn)惡性腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移。早期的研究認(rèn)為，腫瘤本身不形成新生的毛細(xì)淋巴管，腫瘤周圍淋巴管僅僅是正常組織內(nèi)的殘余淋巴管，并無直接證據(jù)表明腫瘤組織能導(dǎo)致淋巴管增生。這種認(rèn)識的形成一方面是技術(shù)限制，無法將血管和淋巴管分開，另一方面可能是人們認(rèn)為淋巴轉(zhuǎn)移也是通過血管再到淋巴。越來越多的研究表明淋巴管生成是轉(zhuǎn)移過程的主要步驟，人類腫瘤表達(dá)的淋巴管生成因子VEGF-C和VEGF-D與腫瘤的轉(zhuǎn)移播散有直接的相關(guān)性。

臨床研究顯示利用單克隆抗體或可溶性VEGFRs阻斷VEGFs與其受體的結(jié)合，阻礙VEGFs信號通路的傳導(dǎo)是目前治療腫瘤的有效方法之一。Genentech公司所研發(fā)Bevacizumab(商品名，Avastin)是一種重組的人鼠嵌合抗體，可通過封閉VEGF-A阻斷其與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體結(jié)合，使VEGFR無法活化而發(fā)揮抗血管生成的作用。Bevacizumab的作用可分為3個(gè)階段：在初期，當(dāng)藥物作用于腫瘤時(shí)，可導(dǎo)致腫瘤血管的退化，使腫瘤體積縮小；繼而可使存活的形態(tài)紊亂、管壁通透性高的腫瘤血管趨向正?；?，將化療藥物更有效地傳遞進(jìn)腫瘤組織內(nèi)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞毒化療藥物的靈敏度；后期，Bevacizumab可進(jìn)一步抑制與腫瘤相關(guān)的血管新生和再生(JainRK..NEnglJMed.2009，360(25)：2669-71.)。該產(chǎn)品目前用于一線治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，將來有可能用于轉(zhuǎn)移性肺癌、乳癌、胰臟癌、腎臟癌等疾病的治療。該產(chǎn)品也是是開發(fā)較為成功的抗體藥物之一，2010年全球銷售額達(dá)到69億美元，排世界最暢銷的藥物第6位。由于可溶性VEGFR不具備跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，因此它與VEGF結(jié)合后不能產(chǎn)生信號傳導(dǎo)，運(yùn)用sVEGFR競爭性結(jié)合循環(huán)VEGFs，消耗腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的VEGFs，阻斷VEGFs功能受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制VEGFs誘導(dǎo)的生物學(xué)功能。VEGFR1和VEGFR2的部分胞外區(qū)域與人IgG恒定區(qū)融合表達(dá)的蛋白(VEGFR1-Fc和VEGFR2-Fc)不僅可以中和VEGF，而且有較長的半衰期。VEGFR1-Fc與VEGFs的親和力比VEGFR2-Fc高出數(shù)百倍(Kuo，C.etal.PNAS，200198，4605-4610)，但是VEGFR1-Fc含有較多的堿性氨基酸，等電點(diǎn)大于9.5，在體內(nèi)較易與呈酸性的基質(zhì)結(jié)合，降低其在血液中的半衰期(2000，CancerRes.60，6253-6258.)。Sanofi-aventis公司和Regeneron公司的JocelynH等研究者研制的VEGF-Trap(aflibercept)，是把VEGFR1胞外第2個(gè)結(jié)構(gòu)域與VEGFR2胞外的第3個(gè)結(jié)構(gòu)域與人的IgG1恒定區(qū)進(jìn)行融合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明VEGF-Trap可有效地抑制腫瘤的生長和血管新生，而且比Avastin有更強(qiáng)的抗腫瘤作用(WulffC等，JClinEndocrinolMetab.2001，86(7)：3377-86；HolashJ等，PNAS2002，17：11393-98)。該融合蛋白能結(jié)合VEGF-A、VEGF-B和PIGF但不能結(jié)合VEGF-C和VEGF-D(CursiefenC，etal：JClinInvest.2004，113(7)：1040-50.)。無論是Bevacizumab還是aflibercept都是通過阻斷VEGF-A或和VEGF-B所誘導(dǎo)的生物學(xué)功能，即抑制腫瘤的血管生成來發(fā)揮抗腫瘤作用。它們均不能與VEGF-C或VEGF-D相結(jié)合，而VEGF-C和VEGF-D可誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)淋巴管生成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。采用分子生物學(xué)方法T等(NatMed.2001Feb；7(2)：199-205)把VEGFR-3配體結(jié)合域在內(nèi)的胞外區(qū)與IgG的Fc偶聯(lián)表達(dá)VEGFR-3-Ig免疫融合蛋白，VEGFR-3-Ig可與VEGF-C或VEGF-D結(jié)合，使VEGF-C或VEGF-D無法進(jìn)行下游的信號傳導(dǎo)(亦被稱作VEGF-C/VEGF-DTrap)，從而達(dá)到抑制淋巴管生成的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGFR-3-Ig可抑制淋巴管生成。Karpanen等(CancerRes，2001，61(5)：1786～1790)在MCF7乳腺癌原位移植模型上也觀察到可溶性VEGFR-3-Ig蛋白可抑制腫瘤淋巴管生成的現(xiàn)象。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種Ultra-VEGF-trap免疫融合蛋白、其制備方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明的Ultra-VEGF-trap免疫融合蛋白，是1)或2)中的蛋白：

1)如SEQID.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

2)如SEQID.1所示的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且抗腫瘤相關(guān)由1)衍生的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的Ultra-VEGF-trap免疫融合蛋白的構(gòu)建方法包括如下步驟：

1)將VEGFR1胞外第2功能結(jié)構(gòu)域編碼基因、VEGFR2胞外的第3功能結(jié)構(gòu)域編碼基因與人的IgG1恒定區(qū)Fc編碼基因連接，得到AmFc1基因，其核苷酸序列如SEQID.2所示；表達(dá)的AmFc1融合蛋白的氨基酸序列如SEQID.3所示，可與VEGF-A或VEGF-B高親和性結(jié)合；所述的融合蛋白AmFc1中的人IgG恒定區(qū)的Fc進(jìn)行了兩個(gè)氨基酸的突變，第357位的E突變?yōu)镵，第399位的D突變?yōu)镵；(Fc氨基酸殘基編號按Kabat數(shù)據(jù)庫)；

2)將VEGFR3胞外第1功能結(jié)構(gòu)域至第3功能結(jié)構(gòu)域編碼基因與人的IgG1恒定區(qū)Fc編碼基因連接，得到核苷酸序列如SEQID.4所示的BmFc2基因，表達(dá)的BmFc2融合蛋白的氨基酸序列如SEQID.5所示，可與VEGF-C或VEGF-D高親和性結(jié)合；所述的融合蛋白BmFc2中人IgG1的恒定區(qū)的Fc進(jìn)行了兩個(gè)氨基酸的突變，第392位的K突變?yōu)镈，第409位的K突變?yōu)镈；(Fc氨基酸殘基編號按Kabat數(shù)據(jù)庫)；

3)將AmFc1和BmFc2這兩種免疫融合蛋白在工程細(xì)胞中組裝成異源二聚體。

通過突變改變了AmFc1和BmFc2免疫融合蛋白接觸面的電荷極性，使形成的表達(dá)產(chǎn)物均為AmFc1和BmFc2的異源二聚體Ultra-VEGF-trap(簡稱UVT)，而非AmFc1或BmFc2的同源二聚體，也非部分為AmFc3和BmFc4的異源二聚體。

所說的工程細(xì)胞選自CHO、293或NS0細(xì)胞。

本發(fā)明的Ultra-VEGF-trap免疫融合蛋白，具有用于制備抗腫瘤藥物的用途。

本發(fā)明的Ultra-VEGF-trap融合蛋白具有與VEGF-A，-B，-C，-D結(jié)合的功能區(qū)，可同時(shí)結(jié)合VEGF-A，-B，-C，-D等多種血管內(nèi)皮生長因子。免疫融合蛋白Ultra-VEGF-trap若進(jìn)入體內(nèi)可以阻礙VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D與它們的受體VEGFR-1(fms-liketyrosinekinase，F(xiàn)lt-1)、VEGFR-2(kinaseinsertdomaincontainingreceptor，KDR/Flk-1)和VEGFR-3(Flt-4)的結(jié)合，抑制腫瘤組織新生血管和淋巴管的生成，達(dá)到抑制腫瘤的生長和通過淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移的目的，具有巨大的、潛在的治療多種惡性腫瘤的價(jià)值。具體地說，Ultra-VEGF-trap融合蛋白具有以下的功能：一方面它能夠阻斷VEGF-A和VEGF-B產(chǎn)生的血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化，增殖，分化和遷移，阻斷腫瘤中新生血管的形成，減少腫瘤的供血和供氧，限制腫瘤的生長，又能降低血管通透性，減少腫瘤通過血管發(fā)生轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)；另一方面，它能阻斷VEGF-C和VEGF-D產(chǎn)生淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的激活，抑制腫瘤組織新生淋巴管的形成，阻礙腫瘤細(xì)胞淋巴管轉(zhuǎn)移途徑。Ultra-VEGF-trap幾乎全部阻斷了VEGFs/VEGFRs傳導(dǎo)途徑，抑制新生血管的形成，降低血管通透性，減少腫瘤的供血和供氧，同時(shí)可以阻斷腫瘤內(nèi)淋巴管生成，抑制腫瘤的淋巴管轉(zhuǎn)移。此外，Ultra-VEGF-trap融合蛋白具有很高的分子量(140kDa)，因而其半衰期明顯延長。因此，Ultra-VEGF-trap免疫融合蛋白在對惡性腫瘤的治療方面有著比已上市Bevacizumab和即將上市aflibercept更多的優(yōu)勢，具有潛在的治療多種惡性腫瘤的價(jià)值。

附圖說明

圖1是融合蛋白Ultra-VEGF-trap結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是PBHL-UVT表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖。其中，Amp：氨芐青霉素抗性，CMVLE：人巨噬細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子，SV40latePolyA：SV40晚期啟動(dòng)子和多腺苷酸信號，GS：谷酰胺合成酶。

圖3是表達(dá)載體內(nèi)切酶鑒定電泳圖，其中，1為分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；2為pBHL-AmFc1；3為pBHL-UVT。

圖4是純化的Ultra-VEGF-trap非還原SDS-PAGE電泳圖，其中1為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2為免疫融合蛋白Ultra-VEGF-trap。

圖5是純化的Ultra-VEGF-trap還原SDS-PAGE電泳圖，其中1為免疫融合蛋白Ultra-VEGF-trap；2為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。

圖6是ELISA檢測Ultra-VEGF-trap與VEGFs的結(jié)合結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1構(gòu)建免疫融合蛋白Ultra-VEGF-trap的表達(dá)載體

1、AmFc1和BmFc2基因的合成

委托上海捷瑞生物工程有限公司合成AmFc1編碼基因序列，其核苷酸序列如SEQID.2所示；AmFc1蛋白的氨基酸序列如SEQID.3所示，其中包括信號肽序列、VEGFR1胞外第2個(gè)區(qū)、VEGFR2胞外的第3個(gè)功能區(qū)，以及人IgG1的恒定區(qū)Fc，其中Fc進(jìn)行了兩個(gè)氨基酸的突變，第357位的E突變?yōu)镵，第399位的D突變?yōu)镵，命名為AmFc1。

同樣委托上海捷瑞生物工程有限公司合成BmFc2編碼基因序列，核苷酸序列如SEQID.4所示；BmFc2蛋白的氨基酸序列如SEQID.5所示，其中包括信號肽序列、VEGFR3胞外第1個(gè)區(qū)、第2個(gè)功能區(qū)和第3個(gè)功能區(qū)，以及人IgG1的恒定區(qū)Fc，其中Fc進(jìn)行了兩個(gè)氨基酸的突變，第392的K突變?yōu)镈，第409位的K突變?yōu)镈，命名為BmFc2。

2、構(gòu)建免疫融合蛋白Ultra-VEGF-trap的表達(dá)載體

1)自捷瑞生物工程有限公司提供的大腸桿菌中提取含AmFc1序列的質(zhì)粒，HinDIII和EcoRI雙酶切后，回收酶切產(chǎn)物。與經(jīng)同樣處理的表達(dá)載體pBHL在T4DNA連接酶作用下16℃連接過夜后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)菌中，在LB(氨芐酶素抗性)培養(yǎng)板中篩選培養(yǎng)，挑取陽性克隆。培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，HinDIII和EcoRI雙酶切鑒定，切出預(yù)期大小的片段，命名為pBHL-AmFc1。

2)基本重復(fù)上述步驟，將捷瑞生物工程有限公司合成的含BmFc2序列的質(zhì)粒和pBHL-AmFc1表達(dá)載體分別用XhoI和XbaI雙酶切后連接，構(gòu)建Ultra-VEGF-trap表達(dá)載體，結(jié)構(gòu)如圖2所示，融合蛋白Ultra-VEGF-trap結(jié)構(gòu)如圖1所示。用XhoI、XbaI、HinDIII和EcoRI4酶切后切出預(yù)期大小的片段，結(jié)果見圖3。

實(shí)施例2免疫融合蛋白Ultra-VEGF-trap的表達(dá)及純化

293F(購自Invitrogen公司，CatNo.11625-019)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)于無血清CD293培養(yǎng)液(購自Invitrogen公司，CatNo.11913-019)中，轉(zhuǎn)染前離心更換新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106細(xì)胞/ml。以100ml細(xì)胞為例，分別將DNA(pT1h-ONC)150μg和PEI300μg(Sigma，Cat.No：408727)加入10ml293培養(yǎng)液中混勻，靜置5min。室溫放置20min后，將PEI/DNA混懸液逐滴加入搖瓶中，輕輕混勻，置于5％CO2、37℃搖床培養(yǎng)(115rpm)5天后收集培養(yǎng)上清。

轉(zhuǎn)染細(xì)胞5天后，收集上清做純化。用pH7.4的PBS溶液平衡HiTrapMabSelectSuRe1ml柱(GEHealthcareLifeSciences產(chǎn)品，Cat.No：11-0034-93)10個(gè)床體積，流速為0.5ml/min；將經(jīng)轉(zhuǎn)染得到的200ml上清液用0.45μm濾膜過濾上樣，流速為0.5ml/min。用pH7.4的PBS溶液再洗5-10個(gè)床體積，流速為0.5ml/min；用100mM檸檬酸緩沖液(pH4.0)洗脫，流速為0.5ml/min，收集洗脫峰。

結(jié)果見圖4和圖5，免疫融合蛋白Ultra-VEGF-trap純度達(dá)到95％以上，免疫融合蛋白的分子量大約140kDa左右，AmFc1和BmFc2的分子量分別為80kDa和60kDa，與理論預(yù)期一致。

實(shí)施例3免疫融合蛋白Ultra-VEGF-trap的功能分析

分別將VEGF165(北京鴻躍創(chuàng)新科技有限公司，cat：100-20)，VEGF-B(北京鴻躍創(chuàng)新科技有限公司，cat：100-20B)、VEGF-C(北京鴻躍創(chuàng)新科技有限公司，cat：100-20C)、VEGF-D(北京鴻躍創(chuàng)新科技有限公司，cat：100-20D)用0.05mmol/L碳酸鈉、碳酸氫鈉緩沖液(pH9.6)稀釋成2μg/mL，100μL/孔，4℃包被過夜；1％PBS-BSA室溫封閉1h后，加入不同濃度的融合蛋白，室溫孵育2h。PBST(0.05％Tween-20)洗滌3次后，加入1∶30000稀釋的堿性鱗酸酶標(biāo)記抗人IgG(中衫金橋，cat：ZB2304)，100μL/孔，室溫孵育45min；PBST洗滌3次后，加入TMD底物顯色液(康為世紀(jì)，cat：CW0050)100μL/孔，避光顯色；加入2M濃硫酸終止反應(yīng)；置酶標(biāo)儀中測定450nm吸光度值。結(jié)果如圖6所示。

結(jié)果表明：免疫融合蛋白Ultra-VEGF-trap可同時(shí)結(jié)合VEGF-165、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D四種不同的可溶性血管內(nèi)皮生長因子結(jié)合，結(jié)合量隨融合蛋白的增加而增加。

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<110>OrganizationName:江蘇健德生物藥業(yè)有限公司

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<120>Title:Ultra-VEGF-trap免疫融合蛋白、其制備方法及其應(yīng)用

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