技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)RET基因融合的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥是目前威脅人類生命和健康的主要疾病，癌細(xì)胞在體內(nèi)無限制、無止境地增生，使患者體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗，癌細(xì)胞也能釋放出多種毒素，使人體產(chǎn)生一系列癥狀；嚴(yán)重患者由于器官功能衰竭而死。

肺癌是目前全世界的最主要癌癥，據(jù)統(tǒng)計(jì)，1995年全世界有60萬人死于肺癌，2003年世界衛(wèi)生組織(WHO)公布的死亡率是110萬/年。肺癌也是嚴(yán)重危害我國(guó)人民生命健康的重大疾病，目前每年我國(guó)肺癌的患病人數(shù)約120萬/年。

已有研究揭示：肺腺癌病人中存在一個(gè)關(guān)鍵致病基因突變：RET基因融合。RET是一個(gè)受體酪氨酸激酶，在正常的肺組織中表達(dá)較低，而在肺癌樣本中往往表達(dá)較高。研究表明，RET基因在肺癌樣本中發(fā)生了基因的融合，該融合來源于染色體DNA水平的轉(zhuǎn)位，可以造成相關(guān)蛋白(如KIF5B或CCDC6)的胞外域與RET的激酶活性區(qū)融合為一個(gè)新的蛋白。

RET基因融合對(duì)于具有RET基因融合的肺腺癌患者的“個(gè)體化”治療具有直接的指導(dǎo)意義。目前已有幾種可能的尋找新的RET基因融合的方法，如：通過全基因組測(cè)序(Wholegenomesequencing)、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(Wholetranscriptomesequencing)、下一代測(cè)序(Nextgenerationsequencing)、或外顯子芯片(Exonarray)等方法對(duì)大量的候選基因進(jìn)行篩選，然后用RACE和RT-PCR來逐一驗(yàn)證。這些方法不僅價(jià)格昂貴，還需要進(jìn)行大量的驗(yàn)證工作來對(duì)候選基因進(jìn)行確認(rèn)，得到的結(jié)果十分粗略，準(zhǔn)確度欠缺，因此不適用于臨床檢測(cè)。此外，SplitFISH可通過識(shí)別RET基因前后兩部分對(duì)應(yīng)的信號(hào)點(diǎn)是否發(fā)生分離的方法來確定RET基因是否發(fā)生了融合，這種方法價(jià)格昂貴，檢測(cè)成本高，病人經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，同時(shí)也不排除基因融合可能會(huì)發(fā)生在同一染色體上較近的位置，此時(shí)SplitFish完全不能夠檢測(cè)。此外，還有利用跨融合位點(diǎn)的引物，用PCR檢測(cè)樣本中已知的RET基因融合，這種方法完全不能夠檢測(cè)未知的融合方式。

因此本領(lǐng)域目前還沒有一種簡(jiǎn)便快捷、價(jià)格低廉、可操作性強(qiáng)的檢測(cè)RET基因融合的方法。因此本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)檢測(cè)RET基因融合的方法

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是提供一種檢測(cè)RET基因融合的方法及其應(yīng)用。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種檢測(cè)待測(cè)樣本中RET基因是否融合的方法，包括步驟：

(1)檢測(cè)所述待測(cè)樣本中RET基因轉(zhuǎn)錄本前部的相對(duì)表達(dá)量，記為PA1，并檢測(cè)RET基因轉(zhuǎn)錄本后部的相對(duì)表達(dá)量，記為PB1，并計(jì)算兩者的相對(duì)表達(dá)比率，記為P值：

(2)將待測(cè)樣品的P值與RET基因未發(fā)生融合樣本的P值進(jìn)行比較，其中，如果待測(cè)樣品的P值與RET基因未發(fā)生融合樣本的P值存在顯著差異，則表示待測(cè)樣本中的RET基因存在融合。

在另一優(yōu)選例中，所述的待測(cè)樣本為mRNA或cDNA。

在另一優(yōu)選例中，所述的P值為PB1/PA1。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟：對(duì)P值存在顯著差異的待測(cè)樣品進(jìn)行分析，從而確認(rèn)RET基因的融合方式。

在另一優(yōu)選例中，所述的分析包括：普通PCR，5’RACE和/或測(cè)序。

在另一優(yōu)選例中，所述RET基因的融合方式為：RET基因發(fā)生融合的位置，和/或與RET基因發(fā)生融合的上游基因(Partner)。

在另一優(yōu)選例中，所述RET基因未發(fā)生融合樣本為：無腫瘤組織的正常樣本，和/或沒有RET基因融合的腫瘤組織樣本。

在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤選自下組：肺癌(如肺腺癌)腫瘤、或甲狀腺癌腫瘤。

在另一優(yōu)選例中，步驟(1)包括步驟：以cDNA樣本為模板，用Real-TimePCR的方法，分別對(duì)RET基因轉(zhuǎn)錄本前部對(duì)應(yīng)的cDNA序列和RET基因轉(zhuǎn)錄本后部對(duì)應(yīng)的cDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，獲得RET基因轉(zhuǎn)錄本前部的相對(duì)表達(dá)量和RET基因轉(zhuǎn)錄本后部的相對(duì)表達(dá)量。

在另一優(yōu)選例中，上述的RET基因轉(zhuǎn)錄本前部對(duì)應(yīng)的cDNA序列為：RET基因的第1外顯子至第7外顯子之間的cDNA序列。

在另一優(yōu)選例中，上述的RET基因轉(zhuǎn)錄本前部對(duì)應(yīng)的cDNA序列如SEQIDNO.：5所示。

在另一優(yōu)選例中，上述的RET基因轉(zhuǎn)錄本后部對(duì)應(yīng)的cDNA序列為：RET基因的第12外顯子至第19外顯子5’端148bp之間的cDNA序列。

在另一優(yōu)選例中，上述的RET基因轉(zhuǎn)錄本后部對(duì)應(yīng)的cDNA序列如SEQIDNO.：6所示。

在另一優(yōu)選例中，使用序列如SEQIDNO.：1和SEQIDNO.：2所示的引物對(duì)，對(duì)RET基因轉(zhuǎn)錄本前部對(duì)應(yīng)的cDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增；使用序列如SEQIDNO.：3和SEQIDNO.：4所示的引物對(duì)，對(duì)RET基因轉(zhuǎn)錄本后部對(duì)應(yīng)的cDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。

在另一優(yōu)選例中，所述的待測(cè)樣品的P值與RET基未發(fā)生融合樣本的P值存在顯著差異為：待測(cè)樣品的P值≥RET基因未發(fā)生融合樣本的P值的2倍，較佳地≥4倍，更佳地≥8倍，最佳地≥10倍，其中所述的P值為PB1/PA1。

在本發(fā)明的第二方面，提供了一種引物集，所述引物集至少包括兩對(duì)引物對(duì)，在適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增條件下，第一引物對(duì)具有擴(kuò)增RET基因轉(zhuǎn)錄本前部對(duì)應(yīng)的cDNA序列的能力；第二引物對(duì)具有擴(kuò)增RET基因轉(zhuǎn)錄本后部對(duì)應(yīng)的cDNA序列的能力。

在另一優(yōu)選例中，在適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增條件下，第一引物對(duì)具有擴(kuò)增RET基因的第1外顯子至第7外顯子之間的一段對(duì)應(yīng)的cDNA序列(較佳地如SEQIDNO.：5所示的序列)的能力；第二引物對(duì)具有擴(kuò)增RET基因的第12外顯子至第19外顯子5’端148bp之間的一段對(duì)應(yīng)的cDNA序列(較佳地如SEQIDNO.：6所示的序列)的能力。

在另一優(yōu)選例中，第一引物對(duì)的序列如SEQIDNO.：1和SEQIDNO.：2所示；第二引物對(duì)的序列如SEQIDNO.：3和SEQIDNO.：4所示。

在本發(fā)明的第三方面，提供了一種含有本發(fā)明第二方面所述引物集的試劑盒。

在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括選自下組的一種或多種試劑：

(i)用于樣本RNA提取和cDNA合成的試劑；

(ii)用于PCR的試劑；

(iii)用于5’RACE的試劑；

(vi)用于測(cè)序的試劑。

在本發(fā)明的第四方面，提供了所述引物集或所述試劑盒的用途，它被用于檢測(cè)待測(cè)樣本中RET基因是否融合和/或確認(rèn)RET基因的融合方式。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。

圖1顯示了RET基因融合的方式。

圖2顯示了腫瘤樣本2LC中KIF5B-RET基因融合的PCR鑒定結(jié)果。

圖3顯示了腫瘤樣本2LC中KIF5B-RET基因融合的測(cè)序結(jié)果。

圖4顯示了腫瘤樣本3LC中ELE1-RET基因融合的測(cè)序結(jié)果。

圖5顯示了腫瘤樣本3LC中ELE1-RET基因融合的PCR鑒定結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次建立了一種檢測(cè)RET基因融合的方法，具體地，包括步驟：(1)檢測(cè)所述待測(cè)樣本中RET基因轉(zhuǎn)錄本前部的相對(duì)表達(dá)量，記為PA1，并檢測(cè)RET基因轉(zhuǎn)錄本后部的相對(duì)表達(dá)量，記為PB1，并計(jì)算兩者的相對(duì)表達(dá)比率，記為P值：(2)將待測(cè)樣品的P值與無RET基因融合的樣本的P值進(jìn)行比較，其中，如果待測(cè)樣品的P值與無RET基因融合的樣本的P值存在顯著差異，則表示待測(cè)樣本中的RET基因存在融合；還可能包括步驟：對(duì)P值存在顯著差異的待測(cè)樣品進(jìn)行5’RACE和測(cè)序分析，從而確認(rèn)RET基因的融合方式。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。

術(shù)語

RET蛋白及其融合

RET蛋白是受體酪氨酸激酶(Receptertyrosinekinases)家族的一員。RET蛋白是一個(gè)跨膜蛋白，有1114個(gè)氨基酸，包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)激酶活性區(qū)，其中第724個(gè)-第1016個(gè)共293個(gè)氨基酸是激酶活性區(qū)。

RET基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的前體RNA經(jīng)過剪切，產(chǎn)生兩種成熟的mRNA。其中，第一種mRNA包含Exon1-Exon18(3229bp)和Exon19b(930bp)，第二種mRNA包含Exon1-18(3229bp)和Exon19a(148bp)、Exon20(2240bp)。即：兩種mRNA的前18個(gè)外顯子序列相同，只是第一種mRNA還有一個(gè)Exon19b，第二種mRNA還有一個(gè)Exon19a和一個(gè)Exon20。但是全長(zhǎng)148bp的Exon19a與全長(zhǎng)930bp的Exon19b前148bp完全相同。

癌癥病人中存在RET基因與其他基因(partner)的融合(圖1)，如在肺癌中KIF5B或CCDC6的胞外域與RET的激酶活性區(qū)融合為一個(gè)新的基因/蛋白。關(guān)于RET基因發(fā)生融合的位置：1)在甲狀腺癌中，TRIM27-RET的融合位點(diǎn)在Exon10前，即從RETExon10開始的部分融合到了TRIM27上；PCM1-RET、CCDC6-RET、GOLGA5-RET、TRIM24-RETandTRIM33-RET融合位點(diǎn)在Exon12前，即從RETExon12開始的部分融合到了Partner上。2)在肺癌中，KIF5B-RET是從RETExon11或Exon8開始的部分或者從RETExon12開始的部分融合到了KIF5B上，CCDC6-RET從RETExon12開始的部分融合到了CCDC6上。

樣本獲得及處理

本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員使用通用的方法即可獲得癌癥樣本，如肺癌樣本可通過穿刺法獲得或者在對(duì)肺癌病人進(jìn)行手術(shù)時(shí)獲得。其他癌癥的樣本可按臨床上的標(biāo)準(zhǔn)方法獲得，比如白血病可以用從病人血液中獲得。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，發(fā)明人在肺癌病人手術(shù)結(jié)束后從腫瘤組織上切取樣本，并于液氮中長(zhǎng)期保存，以防止RNA降解，需要的時(shí)候從液氮中取出，在干冰上切取使用。將切下的樣本立即放入1ml商品化Trizol液中或者RNA抽提試劑盒中的裂解液中，然后用勻漿器將組織勻漿，接下來用通用的方法進(jìn)行RNA抽提。

引物

如本文所用，術(shù)語“引物”指的是在與模板配對(duì)，在DNA聚合酶的作用下能以其為起點(diǎn)進(jìn)行合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈的寡居核苷酸的總稱。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。

引物“大致上”(或“基本上”)與模板上一條鏈上的一個(gè)特殊的序列互補(bǔ)。引物必須與模板的一條鏈充分地互補(bǔ)才能開始延伸，但引物的序列不必與模板的序列完全互補(bǔ)。比如，在一個(gè)3’端與模板互補(bǔ)的引物的5’端加上一段與模板不互補(bǔ)的序列，這樣的引物仍大致上與模板互補(bǔ)。只要有足夠長(zhǎng)的引物能與模板充分的結(jié)合，非完全互補(bǔ)的引物也可以與模板形成引物-模板復(fù)合物，從而進(jìn)行擴(kuò)增。

本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種用于檢測(cè)檢測(cè)RET基因融合的引物集，所述引物集至少包括兩對(duì)引物，一對(duì)引物能擴(kuò)增RET轉(zhuǎn)錄本前部的DNA片段，另一對(duì)引物能擴(kuò)增RET轉(zhuǎn)錄本后部的DNA片段。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，一對(duì)引物能擴(kuò)增RET的Exon1-Exon7之間的序列，一對(duì)引物能擴(kuò)增Exon12-Exon18加上148bp范圍的序列。

Exon1-Exon7之間的序列如下：

agtcccgcgaccgaagcagggcgcgcagcagcgctgagtgccccggaacgtgcgtcgcgc60

ccccagtgtccgtcgcgtccgccgcgccccgggcggggatggggcggccagactgagcgc120

cgcacccgccatccagacccgccggccctagccgcagtccctccagccgtggccccagcg180

cgcacgggcgatggcgaaggcgacgtccggtgccgcggggctgcgtctgctgttgctgct240

gctgctgccgctgctaggcaaagtggcattgggcctctacttctcgagggatgcttactg300

ggagaagctgtatgtggaccaggcggccggcacgcccttgctgtacgtccatgccctgcg360

ggacgcccctgaggaggtgcccagcttccgcctgggccagcatctctacggcacgtaccg420

cacacggctgcatgagaacaactggatctgcatccaggaggacaccggcctcctctacct480

taaccggagcctggaccatagctcctgggagaagctcagtgtccgcaaccgcggctttcc540

cctgctcaccgtctacctcaaggtcttcctgtcacccacatcccttcgtgagggcgagtg600

ccagtggccaggctgtgcccgcgtatacttctccttcttcaacacctcctttccagcctg660

cagctccctcaagccccgggagctctgcttcccagagacaaggccctccttccgcattcg720

ggagaaccgacccccaggcaccttccaccagttccgcctgctgcctgtgcagttcttgtg780

ccccaacatcagcgtggcctacaggctcctggagggtgagggtctgcccttccgctgcgc840

cccggacagcctggaggtgagcacgcgctgggccctggaccgcgagcagcgggagaagta900

cgagctggtggccgtgtgcaccgtgcacgccggcgcgcgcgaggaggtggtgatggtgcc960

cttcccggtgaccgtgtacgacgaggacgactcggcgcccaccttccccgcgggcgtcga1020

caccgccagcgccgtggtggagttcaagcggaaggaggacaccgtggtggccacgctgcg1080

tgtcttcgatgcagacgtggtacctgcatcaggggagctggtgaggcggtacacaagcac1140

gctgctccccggggacacctgggcccagcagaccttccgggtggaacactggcccaacga1200

gacctcggtccaggccaacggcagcttcgtgcgggcgaccgtacatgactataggctggt1260

tctcaaccggaacctctccatctcggagaaccgcaccatgcagctggcggtgctggtcaa1320

tgactcagacttccagggcccaggagcgggcgtcctcttgctccacttcaacgtgtcggt1380

gctgccggtcagcctgcacctgcccagtacctactccctctccgtgagcaggagggctcg1440

ccgatttgcccagatcgggaaagtctgtgtggaaaactgccaggcattcagtggcatcaa1500

cgtccagtacaagctgcattcctctggtgccaactgcagcacgctaggggtggtcacctc1560

agccgaggacacctcggggatcctgtttgtgaatgacaccaaggccctgcggcggcccaa1620

gtgtgccgaacttcactacatggtggtggccaccgaccagcagacctctaggcaggccca1680

ggcccagctgcttgtaacagtggaggggtcat1712

(SEQIDNO：5)

Exon12-Exon18加上148bp的序列如下：

gaggatccaaagtgggaattccctcggaagaacttggttcttggaaaaactctaggagaa60

ggcgaatttggaaaagtggtcaaggcaacggccttccatctgaaaggcagagcagggtac120

accacggtggccgtgaagatgctgaaagagaacgcctccccgagtgagcttcgagacctg180

ctgtcagagttcaacgtcctgaagcaggtcaaccacccacatgtcatcaaattgtatggg240

gcctgcagccaggatggcccgctcctcctcatcgtggagtacgccaaatacggctccctg300

cggggcttcctccgcgagagccgcaaagtggggcctggctacctgggcagtggaggcagc360

cgcaactccagctccctggaccacccggatgagcgggccctcaccatgggcgacctcatc420

tcatttgcctggcagatctcacaggggatgcagtatctggccgagatgaagctcgttcat480

cgggacttggcagccagaaacatcctggtagctgaggggcggaagatgaagatttcggat540

ttcggcttgtcccgagatgtttatgaagaggattcctacgtgaagaggagccagggtcgg600

attccagttaaatggatggcaattgaatccctttttgatcatatctacaccacgcaaagt660

gatgtatggtcttttggtgtcctgctgtgggagatcgtgaccctagggggaaacccctat720

cctgggattcctcctgagcggctcttcaaccttctgaagaccggccaccggatggagagg780

ccagacaactgcagcgaggagatgtaccgcctgatgctgcaatgctggaagcaggagccg840

gacaaaaggccggtgtttgcggacatcagcaaagacctggagaagatgatggttaagagg900

agagactacttggaccttgcggcgtccactccatctgactccctgatttatgacgacggc960

ctctcagaggaggagacaccgctggtggactgtaataatgcccccctccctcgagccctc1020

ccttccacatggattgaaaacaaactctatgg1052

(SEQIDNO：6)

較佳地，引物對(duì)1序列為：

GCTGCATGAGAACAACTGGA(SEQIDNO：1)；和

CCTTGAGGTAGACGGTGAGC(SEQIDNO：2)，

該引物對(duì)跨Exon2和Exon3。

引物對(duì)2序列為：

GGCAATTGAATCCCTTTTTG(SEQIDNO：3)；和

CCGGTCTTCAGAAGGTTGAA(SEQIDNO：4)，

后面的一對(duì)引物跨Exon16和Exon17。

檢測(cè)方法

本發(fā)明提供了一種檢測(cè)RET基因融合的方法。具體地，包括步驟：(1)檢測(cè)所述待測(cè)樣本中RET基因轉(zhuǎn)錄本前部的相對(duì)表達(dá)量，記為PA1，并檢測(cè)RET基因轉(zhuǎn)錄本后部的相對(duì)表達(dá)量，記為PB1，并計(jì)算兩者的相對(duì)表達(dá)比率，記為P值：(2)將待測(cè)樣品的P值與RET基因未發(fā)生融合樣本的P值進(jìn)行比較，其中，如果待測(cè)樣品的P值與RET基因未發(fā)生融合樣本的P值存在顯著差異，則表示待測(cè)樣本中的RET基因存在融合。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，肺癌樣本2LC中PB1/PA1的比值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于作為對(duì)照的正常肺樣本及RET基因未發(fā)生融合的肺癌樣本中PB1/PA1比值，也大于作為對(duì)照的確定不具有RET基因融合的肺癌樣本的PB1/PA1比值，表明該樣本中RET基因后半部分相對(duì)前半部分發(fā)生了高表達(dá)，即有RET基因融合存在。然后分別用識(shí)別已知RET基因融合的特異性引物對(duì)該樣本cDNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該融合為已知的KIF5B-RET基因融合。

該檢測(cè)方法除了可以指示已知的RET基因融合(如肺癌中已知CCDC6和-RET和、KIF5B和-RET兩個(gè)基因融合)外，還能對(duì)未知的RET基因融合進(jìn)行準(zhǔn)確指示。在本發(fā)明的另一個(gè)具體的實(shí)施例中，肺癌樣本3LC中PB1/PA1比值為遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于作為對(duì)照的正常肺樣本及RET基因未發(fā)生融合的肺癌樣本中PB1/PA1比值，也大于作為對(duì)照的確定不具有RET基因融合的肺癌樣本的PB1/PA1比值，表明該樣本中RET基因后半部分相對(duì)前半部分發(fā)生了高表達(dá)，即有RET基因融合存在。然后分別用識(shí)別已知RET基因融合的特異性引物對(duì)該樣本cDNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，沒有得到陽性條帶，表明該樣本的RET基因融合不是已知融合方式；然后通過5’RACE和測(cè)序找到了該樣本中與RET基因融合的新基因。

試劑盒

本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)RET基因融合的試劑盒，在一個(gè)優(yōu)選例中，包括組分：

組分1(引物對(duì)1)：

Exon(2-3)-F：GCTGCATGAGAACAACTGGA(SEQIDNO：1)；

Exon(2-3)-R：CCTTGAGGTAGACGGTGAGC(SEQIDNO：2)。

組分2(引物對(duì)2)：

Exon(16-17)-F：GGCAATTGAATCCCTTTTTG(SEQIDNO：3)；

Exon(16-17)-R：CCGGTCTTCAGAAGGTTGAA(SEQIDNO：4)。

組分3：用于樣本RNA提取和cDNA合成的試劑。

組分4：用于PCR的試劑。

組分5：用于5’RACE的試劑。

組分6：用于測(cè)序的試劑。

本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)本發(fā)明方法簡(jiǎn)便快捷，只要獲得cDNA，然后Real-TimePCR檢測(cè)即可即時(shí)得到結(jié)果；

(2)本發(fā)明方法經(jīng)濟(jì)實(shí)用，價(jià)格低廉，能極大地減輕病人經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)；

(3)本發(fā)明方法靈敏度極高，樣本中腫瘤比例極低時(shí)即可檢測(cè)出來；

(4)本發(fā)明除了檢測(cè)已知的RET基因融合，還能檢測(cè)未知的RET基因融合。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1

用于檢測(cè)的腫瘤樣本和對(duì)照樣本可以使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法獲得：從腫瘤組織上切取樣本，迅速凍于液氮以防止RNA降解。

使用北京天根生化科技有限公司的DNA/RNA共提取試劑盒，按照說明書，進(jìn)行RNA的抽提，獲得高純度的RNA；使用fermentas公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將獲得的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

實(shí)施例2

本實(shí)施例中，設(shè)計(jì)了針對(duì)融合區(qū)域的兩對(duì)引物序列如下：

引物對(duì)1為

Exon(2-3)-F：GCTGCATGAGAACAACTGGA(SEQIDNO：1)，和

Exon(2-3)-R：CCTTGAGGTAGACGGTGAGC(SEQIDNO：2)；

該引物對(duì)跨Exon2和Exon3。

引物對(duì)2為

Exon(16-17)-F：GGCAATTGAATCCCTTTTTG(SEQIDNO：3)，和

Exon(16-17)-R：CCGGTCTTCAGAAGGTTGAA(SEQIDNO：4)；

后面的一對(duì)引物跨Exon16和Exon17。

PCR擴(kuò)增請(qǐng)按所使用的兩對(duì)引物的具體退火溫度和所使用的Real-TimePCR儀的具體要求執(zhí)行。使用以上的兩對(duì)引物，在Real-TimePCR儀(型號(hào)為Abi7500fast)上進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：50℃2min，95℃2min；95℃15s，60℃30s(40個(gè)循環(huán))。

實(shí)施例3

對(duì)實(shí)施例2獲得的Real-TimePCR結(jié)果進(jìn)行處理，引物對(duì)1擴(kuò)增得到的相對(duì)表達(dá)量記為：PA1，引物對(duì)2擴(kuò)增得到的相對(duì)表達(dá)量記為：PB1。正常肺組織的cDNA樣本(或者確定沒有RET基因融合的腫瘤cDNA樣本)做對(duì)照，得到基礎(chǔ)的PB1/PA1比值。將肺癌的cDNA樣本和正常肺組織的cDNA樣本分別按7∶0、6∶1、5∶2、4∶3、3∶4、2∶5、1∶6、0.5∶6.5、和0∶7的比例混合，模擬腫瘤比例分別為70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、0％時(shí)用該方法檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

由表1可知，在腫瘤比例為0％時(shí)，PB1/PA1比值為：1.36，這是確定無RET基因融合的基礎(chǔ)比值；而在腫瘤比例低至5％時(shí)PB1/PA1比值為：6.27，遠(yuǎn)大于基礎(chǔ)比值1.36，因此能夠很好地指示RET基因融合的存在。

表1

*混合樣本相對(duì)于初始1LC(腫瘤比率為70％)的腫瘤比率。

實(shí)施例4和實(shí)施例5

在實(shí)施例4中，用該方法分析了部分樣本，發(fā)現(xiàn)在肺癌樣本2LC中PB1/PA1比值為8.09，而作為對(duì)照的正常肺樣本4NL和5NL中PB1/PA1比值分別為1.46和1.40，作為對(duì)照的確定不具有RET基因融合的肺癌樣本6LC和7LC中PB1/PA1比值分別為1.91和2.03。

表2

結(jié)果表明，樣本2LC中RET基因后半部分相對(duì)前半部分發(fā)生了高表達(dá)，即有RET基因融合存在。分別用識(shí)別CCDC6-RET和KIF5B-RET基因融合(肺癌中已知的兩個(gè)RET基因融合)的特異性引物對(duì)樣本2LC的cDNA進(jìn)行了普通PCR檢測(cè)和測(cè)序鑒定，發(fā)現(xiàn)該RET基因融合是KIF5B-RET，從RET基因Exon12開始的部分融合到了KIF5B基因Exon15后面(圖2，圖3)。

檢測(cè)CCDC6-RET基因融合的引物序列如下：

F：GCTGGAGACCTACAAACTGA(SEQIDNO：7)

R：CGTTGCCTTGACCACTTTTC(SEQIDNO：8)

檢測(cè)KIF5B-RET基因融合的引物序列：

F：GTGAAACGTTGCAAGCAGTTAG(SEQIDNO：9)

R：CCTTGACCACTTTTCCAAATTC(SEQIDNO：10)

實(shí)施例5中，該檢測(cè)方法還能對(duì)未知的RET基因融合進(jìn)行準(zhǔn)確指示。

表3

如表3所示，樣品3LC中PBI/PA1比值為9.26，也遠(yuǎn)大于作為對(duì)照的4NL、5NL、6LC、7LC，即表明該樣本中RET基因后半部分相對(duì)前半部分也發(fā)生高表達(dá)，有RET基因融合存在。用CCDC6-RET和KIF5B-RET的鑒定引物進(jìn)行了普通PCR反應(yīng)，沒有得到陽性條帶，表明該樣本中的RET基因融合不是已知的CCDC6-RET和KIF5B-RET基因融合，而可能是一個(gè)新的RET基因融合。

用5’RACE對(duì)新的RET基因融合進(jìn)行檢測(cè)，簡(jiǎn)要方法如下：將抽提的RNA作為模板，根據(jù)5’RACE試劑盒(購(gòu)于德國(guó)Qiagen公司)說明書，設(shè)計(jì)RET基因后半段特異性的一條反向引物，然后按照說明書中的步驟完成5’RACE實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增出5’端的序列，然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的RET基因融合ELE1-RET，由此找到了肺癌中RET基因融合的一個(gè)新的Partner：ELE1，從RET基因Exon12開始的部分融合到了ELE1基因Exon9后面(圖4)。接下來用一對(duì)識(shí)別ELE1-RET基因融合的特異性引物對(duì)3LCcDNA樣本進(jìn)行普通PCR反應(yīng)，得到了ELE1-RET基因融合特異性的擴(kuò)增條帶(圖5)。檢測(cè)ELE1-RET基因融合的引物序列為：

F：TGGAGAAGAGAGGCTGTATC(SEQIDNO：11)；和

R：TGCAGGCCCCATACAATTTG(SEQIDNO：12)。

實(shí)施例6

試劑盒

實(shí)施例提供了一種試劑盒，包括組分：

組分1(第一引物對(duì))：

Exon(2-3)-F：GCTGCATGAGAACAACTGGA(SEQIDNO：1)

Exon(2-3)-R：CCTTGAGGTAGACGGTGAGC(SEQIDNO：2)

組分2(第二引物對(duì)2)：

Exon(16-17)-F：GGCAATTGAATCCCTTTTTG(SEQIDNO：3)

Exon(16-17)-R：CCGGTCTTCAGAAGGTTGAA(SEQIDNO：4)

組分3：用于樣本RNA提取和cDNA合成的試劑。

組分4：用于PCR的試劑(包括Real-TimePCR和普通PCR的試劑)。

組分5：用于5’RACE的試劑。

組分6：用于測(cè)序的試劑。

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