技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種試劑盒，尤其是一種大鯢致病性嗜水氣單胞菌PCR診斷試劑盒。

背景技術(shù)：

嗜水氣單胞菌（Aeromonashydrophila）屬于氣單胞菌科（Aermonadaceae）氣單胞菌屬（Aeromonas），是革蘭氏陰性短桿菌，是一類廣泛存在于水環(huán)境的常見菌，對水產(chǎn)動物、畜禽和人類均有致病性。該菌可引起大鯢的頭部、腹部、尾部皮膚局部出血、壞死，隨著病情的加重，可出現(xiàn)多個內(nèi)臟器官發(fā)生了腫脹、嚴重充血等病理變化。目前，該菌的檢測方法主要有鑒別培養(yǎng)基、Dot-ELISA、間接ELISA等檢測技術(shù)，但這些方法都存在著操作復(fù)雜、耗時較長的缺點。近年來隨著全國各地大鯢產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，大鯢引種頻繁，該病成暴發(fā)趨勢，給大鯢養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是：提供一種大鯢致病性嗜水氣單胞菌PCR診斷試劑盒，它可以快速檢測大鯢致病性嗜水氣單胞菌，并且簡便、靈敏、準確、特異性強。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：大鯢致病性嗜水氣單胞菌PCR診斷試劑盒，它包括250μL的PCRpremix緩沖液，150μL超純水，50μL的MarkerDL2000，40μL濃度為10μmol/L的上引物及40μL濃度為10μmol/L的下引物，20μL陰性對照以及20μL陽性對照；上游引物的序列為：5`-AGTCCGCGAAGAAGTTTTTGTAC-3`；下游引物的序列為：5`-TTCATGAGGTCCCAGGCCAGGT-3`。

陰性對照為超純水。

陽性對照為標準致病性嗜水氣單胞菌的PCR產(chǎn)物。

試劑盒的保存期檢測

將試劑盒保存在4℃、-20℃分別于1月、3月、6月、1年，對陽性樣品進行檢測，4℃保存1年條帶較淡，－20℃保存1月、3月、6月、1年條帶亮度無影響。

本發(fā)明本研究根據(jù)GenBank中的致病性嗜水氣單胞菌氣溶素基因（hlyA）序列，設(shè)計了1對引物，通過對PCR反應(yīng)條件進行優(yōu)化，建立了檢測大鯢致病性嗜水氣單胞菌的PCR診斷法方法，以期對臨床樣品進行簡便、快捷、靈敏、準確的檢測，為該病的防制提供科學(xué)依據(jù)。

本研究根據(jù)GenBank中嗜水氣單胞菌氣溶素基因的序列，設(shè)計1對特異性引物，通過對PCR反應(yīng)條件進行優(yōu)化，建立了檢測大鯢致病性嗜水氣單胞菌的PCR診斷法方法，與傳統(tǒng)的細菌分離鑒定相比較，建立的PCR檢測方法操作更為簡便，耗時較短，且容易區(qū)分致病株與非致病株。該PCR試劑盒能夠?qū)Υ篥F致病性嗜水氣單胞菌樣品進行快捷、靈敏、準確的檢測，有利于該病的快速診斷及流行病學(xué)調(diào)查。

為了驗證本發(fā)明的技術(shù)效果，進行了以下實驗：

大鯢致病性嗜水氣單胞菌PCR診斷方法的建立

1材料與方法

1.1菌株致病性嗜水氣單胞菌標準株、非致病性嗜水氣單胞菌購自中國獸醫(yī)微生物保藏管理中心，大腸桿菌、黃桿菌、弗氏檸檬酸桿菌由貴州省畜禽疫病研究實驗室保存。

主要試劑Goldview、Tris、EDTA、DL2000、TaqDNAPolymerase（5U/μL）及相應(yīng)10×TaqBuffer、dNTP等購自寶生物（大連）工程有限公司；苯酚、氯仿、無水乙醇、普通培養(yǎng)基為國產(chǎn)試劑。

引物設(shè)計

根據(jù)嗜水氣單胞菌氣溶素基因（hlyA）序列設(shè)計1對特異性引物，上游引物：5’-AGAAGGTGACCACCAAGAACAAG-3’，下游引物：5’-AATGCTGCTCGCCTTGTCCT-3’，引物由寶生物（大連）工程有限公司合成。

細菌核酸的抽提

（1）菌液樣品DNA的提取

將待檢菌液按12000r/min離心5min，棄上清液，用100μLTE或滅菌雙蒸水重懸，渦漩后，于沸水中水浴10min，再放置-20℃凍融。凍融后12000r/min離心5min，收集上清液，上清液-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）組織樣品

取待檢樣品肝臟組織樣品共約0.5g，加入500μLPBS緩沖液，待檢樣品研磨后－20℃反復(fù)凍融3次12000r/min離心取上清用于核酸的提取。取上述處理好的樣品500μL于1.5mL離心管中，每管加50μL消化緩沖液，加蛋白酶K至終濃度100μg/mL混勻，55℃水浴1h。從水浴中取出消化后的樣品，在每管中加入飽和苯酚600μL，充分震蕩搖勻之后常溫12000r/min離心10min；取上清液約400μL，加入200μL的苯酚和200μL的氯仿溶液，震蕩搖勻，常溫12000r/min離心10min；取上清液再加入兩倍體積的預(yù)冷無水乙醇，搖勻后置-20℃沉淀30min；常溫12000r/min離心10min，然后棄去上清液，加入1mL75%的酒精常溫10000r/min離心5min洗滌一次后，將所得核酸沉淀物放在42℃烘箱內(nèi)烘干，或室溫放置自然晾干，在每管中加入50μL左右的TE溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

反應(yīng)條件的優(yōu)化

對PCR反應(yīng)條件，包括退火溫度（52℃、57℃、62℃），引物濃度（5μmol/L、10μmol/L20μmol/L），TaqDNApolymerase濃度（0.5U、1U、2U）進行優(yōu)化，以確定最佳反應(yīng)條件，同時以超純水作為空白對照。PCR反應(yīng)在25μL反應(yīng)體系中進行，10×TaqBuffer5μL，dNTPmixture4μL，TaqDNApolymerase1μL，用超純水補足至25μL。反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃1min，退火溫度（52℃、57℃、62℃）1min，72℃1min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。取10μLPCR擴增產(chǎn)物于10g/L瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定。

敏感性試驗

將提取的致病性嗜水氣單胞菌標準株核酸用蛋白質(zhì)核酸儀測定濃度后，進行10倍比稀釋后分別進行PCR反應(yīng)，以確定建立的PCR診斷試劑盒的敏感性。

特異性試驗

以致病性嗜水氣單胞菌、非致病性嗜水氣單胞菌、大腸桿菌、黃桿菌、弗氏檸檬酸桿菌進行PCR反應(yīng)，以確定建立的PCR診斷方法的特異性。

重復(fù)性試驗

應(yīng)用建立PCR方法，重復(fù)檢測致病性嗜水氣單胞菌DNA樣品3次以檢驗結(jié)果的可靠性。

方法對臨床樣品的檢測

對2011～2012年貴州省貴陽市、黔南州、銅仁地區(qū)幾個大鯢養(yǎng)殖場和養(yǎng)殖專業(yè)戶采集的63份病料應(yīng)用建立的大鯢致病性嗜水氣單胞菌PCR檢測方法進行檢測，同時進行細菌學(xué)和生化檢驗。

結(jié)果

2.1PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化與鑒定

致病性嗜水氣單胞菌的PCR擴增片段經(jīng)膠回收，送大連寶生物工程有限公司測序，結(jié)果表明，擴增片段分別為致病性嗜水氣單胞菌氣溶素基因特異性條帶。PCR反應(yīng)在25μL反應(yīng)體系中最佳反應(yīng)條件為，退火溫度57℃，TaqDNApolymerase0.5U，引物濃度10μmol/L用引物均有效擴增出了其目的片段，片段大小為600bp，無非特異性片段產(chǎn)生，如圖1所示。

敏感性試驗

將提取的致病性嗜水氣單胞菌標準株核酸用蛋白質(zhì)核酸儀測定濃度為20μg，進行10倍比稀釋后分別進行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)中，致病性嗜水氣單胞菌DNA的最低檢測量為0.4ng/L，如圖2所示。

特異性試驗

以致病性嗜水氣單胞菌、非致病性嗜水氣單胞菌、大腸桿菌、黃桿菌、弗氏檸檬酸桿菌進行PCR反應(yīng)，以確定建立的PCR診斷試劑盒的特異性，結(jié)果嗜水氣單胞菌為陽性，而非致病性嗜水氣單胞菌、大腸桿菌、黃桿菌、弗氏檸檬酸桿菌為陰性，如圖3所示。

重復(fù)性試驗

應(yīng)用建立的PCR方法，重復(fù)檢測致病性嗜水氣單胞菌DNA樣品3次，結(jié)果均一致。

試劑盒對臨床樣品的檢測

對2011年～2012年貴州省貴陽市、黔南州、銅仁地區(qū)幾個大鯢養(yǎng)殖場和養(yǎng)殖專業(yè)戶采集的123份病料應(yīng)用建立的大鯢致病性嗜水氣單胞菌PCR檢測方法進行檢測，共檢測出82份陽性樣品，而細菌學(xué)和生化檢驗結(jié)果為80份，建立的PCR方法檢測結(jié)果與細菌學(xué)和生化檢驗符合率為97.6％。

討論

近年來隨著大鯢的人工養(yǎng)殖不斷發(fā)展，大鯢的疾病不斷暴發(fā)，主要以嗜水氣單胞菌引起的腹水病、腐皮病、細菌性敗血癥為主。人工養(yǎng)殖中通常在引種運輸，或是養(yǎng)殖水環(huán)境惡化，以及大鯢自身抵抗力下常常暴發(fā)該病。

嗜水氣單胞菌廣泛存在于水環(huán)境中,是一種條件致病菌。嗜水氣單胞菌有致病菌株與非致病菌株之分，嗜水氣單胞菌的致病性與其胞外產(chǎn)物即毒力因子密切相關(guān)，目前已發(fā)現(xiàn)的毒力因子有外毒素、蛋白酶、S層、菌毛、轉(zhuǎn)鐵蛋白和外膜蛋白等，而已確定的外毒素有氣溶素（Aerolysin）、溶血素（Hemolysin）、溶血毒素(（Hemolytictoxin）和細胞毒性腸毒素（Cytolyticenterotoxin）等。目前研究者應(yīng)用致病性嗜水氣單胞菌氣溶素基因的特異性，開展了大量的研究。饒靜靜等根據(jù)GenBank中登錄的嗜水氣單胞菌的氣溶素基因（hlyA）、溶血素基因（aerA），建立了檢測致病性嗜水氣單胞菌的多重PCR檢測方法，對8株嗜水氣單胞菌、16株相關(guān)菌株進行多重PCR檢測，結(jié)果顯示，非致病性分離株均未擴增出毒力基因hlyA和aerA，而致病性分離株均含有hlyA基因。盧強等根據(jù)致病性嗜水氣單胞菌氣溶素基因，設(shè)計引物，建立了檢測嗜水氣單胞菌的PCR方法，通過對20株嗜水氣單胞菌，12株相關(guān)菌株及157份送檢病料的檢測，并與SPA-CoA檢測結(jié)果對照表明，PCR方法具有較高的敏感性和特異性，可檢測最低100cfu的細菌。

由于采用了上述的技術(shù)方案，本發(fā)明根據(jù)GenBank中嗜水氣單胞菌氣溶素基因的序列，設(shè)計1對特異性引物，通過對PCR反應(yīng)條件進行優(yōu)化，建立了檢測大鯢致病性嗜水氣單胞菌的PCR診斷法方法，與傳統(tǒng)的細菌分離鑒定相比較，建立的PCR檢測方法操作更為簡便，耗時較短，且容易區(qū)分致病株與非致病株。建立的PCR方法檢測結(jié)果與細菌學(xué)和生化檢驗符合率為97.6％，表明該PCR方法能夠?qū)Υ篥F致病性嗜水氣單胞菌樣品進行快捷、靈敏、準確的檢測，有利于該病的快速診斷及流行病學(xué)調(diào)查。

具體實施方式

本發(fā)明的實施例：大鯢致病性嗜水氣單胞菌PCR診斷試劑盒，它包括250μL的PCRpremix緩沖液，150μL超純水，50μL的MarkerDL2000，40μL濃度為10μmol/L的上引物及40μL濃度為10μmol/L的下引物，20μL陰性對照以及20μL陽性對照；上游引物的序列為：5’-AGAAGGTGACCACCAAGAACAAG-3’，下游引物：5’-AATGCTGCTCGCCTTGTCCT-3’；陰性對照為超純水；陽性對照為標準致病性嗜水氣單胞菌的PCR產(chǎn)物。

SEQUENCELISTING

序列表

<110>貴州省畜牧獸醫(yī)研究所

<120>大鯢致病性嗜水氣單胞菌PCR診斷試劑盒

<130>nm:

<160>2

<170>PatentInversion

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)嗜水氣單胞菌氣溶素基因（hlyA）序列設(shè)計1對特異性引物，用DNAStar軟件設(shè)計,以用于PCR擴增。

，下游引物：

<400>1

AGAAGGTGACCACCAAGAACAAG23

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)嗜水氣單胞菌氣溶素基因（hlyA）序列設(shè)計1對特異性引物，用DNAStar軟件設(shè)計,以用于PCR擴增。

<400>2

AATGCTGCTCGCCTTGTCCT20