技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種水污染鑒定評(píng)價(jià)方法，尤其涉及的是一種基于人鼠雜交瘤細(xì)胞的水體有機(jī)污染的毒性評(píng)價(jià)方法。

背景技術(shù)：

當(dāng)前，世界水源污染的狀況已經(jīng)十分嚴(yán)重。據(jù)稱，全世界每年約有4200多億立方米的污水排入江河湖海，污染了55000億立方米的淡水，約占全球徑流量的14%以上。而且，目前還正呈日益惡化的趨勢(shì)。由于水源被重金屬離子以及有毒的有機(jī)物污染，因此嚴(yán)重威脅到人類的健康。這些物質(zhì)可引起人們畸形、患癌癥、器官病變。目前，我國(guó)在環(huán)境領(lǐng)域方面的研究多集中于環(huán)境中有毒化學(xué)物質(zhì)的檢測(cè)方法和相關(guān)技術(shù)的開發(fā)，以及有毒有害物質(zhì)環(huán)境濃度的監(jiān)測(cè)上，或者停留在傳統(tǒng)流行病學(xué)調(diào)查的基礎(chǔ)上。對(duì)于效應(yīng)解析，國(guó)內(nèi)學(xué)者的研究也僅僅停留在濃度水平和一些毒性數(shù)據(jù)或環(huán)境基準(zhǔn)的相對(duì)比較上，很少涉及定量評(píng)估，遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于歐美日等發(fā)達(dá)國(guó)家。

國(guó)內(nèi)外研究表明，水污染的預(yù)警和評(píng)價(jià)大多是針對(duì)長(zhǎng)期、低劑量暴露的遺傳毒性物質(zhì)。為了能夠全面地評(píng)價(jià)化合物的遺傳毒性，需要采用一系列的遺傳毒性物質(zhì)的致癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)方法：人群流行病學(xué)調(diào)查、哺乳動(dòng)物致癌試驗(yàn)、致突變?cè)囼?yàn)及體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。但是污染水環(huán)境的有毒化合物并不都是遺傳毒性的，通過一些致癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)方法無(wú)法真實(shí)地反映水污染情況。而本發(fā)明采用的檢測(cè)終點(diǎn)—細(xì)胞克隆形成能力，對(duì)于水環(huán)境中有毒化合物的種類沒有選擇性，可以靈敏地反映任何區(qū)域水介質(zhì)中的任何有毒混合物對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。目前國(guó)內(nèi)主要基于物理和化學(xué)原理研發(fā)了一系列水污染檢測(cè)和預(yù)警的系統(tǒng)或裝置，相關(guān)專利申請(qǐng)如：中國(guó)專利CN101882350A，基于微生物燃料電池原理的水污染生物預(yù)警系統(tǒng)和方法，將該系統(tǒng)安裝于待監(jiān)測(cè)水體，原水進(jìn)入微生物燃料電池（MFC）敏感單元，調(diào)整外電阻大小使得系統(tǒng)靈敏度最高，MFC敏感單元的輸出電壓/電流由信號(hào)采集單元采集，經(jīng)計(jì)算處理后進(jìn)行上傳存儲(chǔ)并實(shí)時(shí)顯示在顯示屏上。中國(guó)專利CN101692034A，便攜式水污染物在線檢測(cè)裝置，該裝置采用導(dǎo)流方式將待測(cè)水樣引導(dǎo)到會(huì)聚高斯光束的束腰區(qū)，通過透過率起伏法測(cè)量水中微米級(jí)顆粒污染物的平均粒徑和顆粒數(shù)濃度，通過DSP進(jìn)行信號(hào)采集和處理。但是這些技術(shù)檢測(cè)水污染的原理均是基于污染物的物理或化學(xué)特性，不能反映出污染物的潛在毒性危害。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種基于人鼠雜交瘤細(xì)胞的水體有機(jī)污染的毒性評(píng)價(jià)方法，模擬了更為接近實(shí)際的一套水污染環(huán)境對(duì)生物體有害影響的系統(tǒng)，對(duì)水污染毒性的鑒定具有更高指導(dǎo)性的意義。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括以下步驟：

（1）萃取水樣中的有機(jī)物；

（2）用水樣有機(jī)物對(duì)人鼠雜交瘤細(xì)胞AL細(xì)胞進(jìn)行染毒處理；

（3）克隆培養(yǎng)

a、將染毒處理后的人鼠雜交瘤細(xì)胞種植在經(jīng)過寬離子束輻照改性后的培養(yǎng)皿中；

b、將培養(yǎng)皿在37℃，體積濃度為5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10天形成細(xì)胞克隆；

（4）毒性量化

c、對(duì)培養(yǎng)皿中的細(xì)胞克隆用PBS緩沖液清洗1～3次，使用固定液固定15～30分鐘，用移液器吸去固定液，然后使用亞甲基藍(lán)染液對(duì)細(xì)胞克隆染色，染色6～24小時(shí)，流水洗除染液后，空氣干燥；

d、計(jì)數(shù)培養(yǎng)皿中細(xì)胞克隆的個(gè)數(shù)，使用下面公式對(duì)水樣的毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)：

細(xì)胞種植率%=培養(yǎng)皿中的細(xì)胞克隆數(shù)/所種植的細(xì)胞數(shù)×100%；

細(xì)胞存活率%=處理組細(xì)胞種植率%/對(duì)照細(xì)胞種植率%×100%。

所述步驟（1）中，萃取水樣的裝置包括原水容器、丙酮容器、氮?dú)馄?、萃取柱、廢液容器、富集液容器、第一閥門、第二閥門、第三閥門、第四閥門和三通閥，所述原水容器和第一閥門連通，氮?dú)馄糠謩e連接第二閥門和第四閥門，丙酮容器和第三閥門連通，廢液容器和富集液容器分別連通三通閥，萃取柱的入口分別連通第一閥門、第三閥門和第二閥門，萃取柱的出口連通三通閥。

所述萃取柱內(nèi)的填料是質(zhì)量比為1:1～1:3的親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮。

所述步驟（2）中，染毒處理的方法為：用4℃冰浴的無(wú)水乙醇對(duì)水樣有機(jī)物溶解，無(wú)水乙醇和水樣有機(jī)物所在原水的體積比為1:100000～1:125000，染毒處理4～24小時(shí)。無(wú)水乙醇相比于DMSO等其他有機(jī)溶劑成本更低，另外，4℃冰浴無(wú)水乙醇能夠最大程度地減少溶解的水體有機(jī)污染物熱失活或變性。

所述步驟a中，寬離子束輻照的能量為10～20keV，劑量為10～20kGy，輻射時(shí)間為5～20min。

所述步驟c中，固定液為甲醇:乙酸按體積比8:1～10:1混合而成。

所述步驟c中，每次染色前對(duì)亞甲基藍(lán)染液超聲處理30分鐘，增加了染液的分散性，使得染色的效果更好，并避免染液中顆粒物造成的假陽(yáng)性干擾。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明利用人鼠雜交瘤細(xì)胞模型和細(xì)胞克隆形成能力終點(diǎn)，真實(shí)客觀地評(píng)價(jià)了水體有機(jī)污染的生物毒性；對(duì)不同類型的水體有機(jī)污染進(jìn)行基于生物體的毒性評(píng)價(jià)，彌補(bǔ)了單純依靠水體理化指標(biāo)變化對(duì)水質(zhì)污染進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)估的不足；對(duì)毒物的種類不具有特異性，適用范圍廣；

本發(fā)明設(shè)計(jì)的萃取裝置，能夠?qū)崟r(shí)在線萃取不同類型水體中的有機(jī)污染物，具有自動(dòng)化程度高、快速準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)；

培養(yǎng)皿經(jīng)過寬離子束輻照改性后更加有利于細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)皿的附著，有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活，以及提高該評(píng)價(jià)方法的精準(zhǔn)度；

亞甲基藍(lán)染液相比于結(jié)晶紫染液和吉姆薩染液，其成本更低，對(duì)細(xì)胞的毒性更小，具有很好的經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益，因此選用該染液對(duì)細(xì)胞克隆進(jìn)行染色。

每次染色前對(duì)亞甲基藍(lán)染液超聲處理30分鐘能夠增加染液的分散性，使得染色的效果更好，并避免染液中顆粒物造成的假陽(yáng)性干擾。

附圖說明

圖1是本發(fā)明萃取水樣的裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是豐水期五個(gè)選樣點(diǎn)水樣富集物對(duì)細(xì)胞存活率的影響；

圖3是枯水期五個(gè)選樣點(diǎn)水樣富集物對(duì)細(xì)胞存活率的影響。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例1

檢測(cè)賈魯河豐水期水樣富集物對(duì)細(xì)胞存活率的影響。

本實(shí)施例包括以下步驟：

（1）萃取水樣中的有機(jī)物；

如圖1所示，本實(shí)施例的萃取水樣的裝置包括原水容器1、丙酮容器2、氮?dú)馄?、萃取柱4、廢液容器5、富集液容器6、第一閥門7、第二閥門8、第三閥門9、第四閥門10和三通閥11，所述原水容器1和第一閥門7連通，氮?dú)馄?分別連接第二閥門8和第四閥門10，丙酮容器2和第三閥門9連通，廢液容器5和富集液容器6分別連通三通閥11，萃取柱4的入口分別連通第一閥門7、第三閥門9和第二閥門8，萃取柱4的出口連通三通閥11。三通閥11為L(zhǎng)型。

由于酸性物質(zhì)容易滲透到地下水中，因此為了富集酸性的遺傳毒性物質(zhì)，水樣用鹽酸調(diào)pH為3。本實(shí)施例的萃取柱4為HLB柱（固相萃取柱），萃取柱4內(nèi)的填料是質(zhì)量比為1:2的親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮，用來富集水樣中的遺傳毒性物質(zhì)，一根HLB柱的上樣量為2L，上樣速度為8mL/min，富集完畢，采用氮?dú)獯蹈傻臐饪s方法。

具體萃取方法如下：取2L的原水至裝置的原水容器1中，打開第一閥門7和三通閥11，控制第一閥門7的大小，使其以8mL/min流過萃取柱4，廢液流入廢液容器5中；

打開第二閥門8，用普通氮?dú)獯蹈筛患怂畼拥妮腿≈?；

將10ml丙酮注入丙酮容器2中，打開第三閥門9和三通閥11，讓丙酮自然流過萃取柱4，洗脫下來的有機(jī)物進(jìn)入了富集樣品的富集液容器6中；

打開第四閥門10，用普通氮?dú)鈱?duì)富集樣品的富集液容器6中的有機(jī)物進(jìn)行氮吹濃縮。

（2）對(duì)水樣有機(jī)物中的AL細(xì)胞進(jìn)行染毒處理，用4℃冰浴的20ul無(wú)水乙醇加入到2L水樣中，溶解其中的水樣有機(jī)物，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AL細(xì)胞分別與1ml/ml,10ml/ml,50ml/ml（每毫升培養(yǎng)基中含有的水樣富集物的量）的水樣富集物共同孵育1，8，16天；

（3）克隆培養(yǎng)

a、將染毒處理后的細(xì)胞種植在經(jīng)過寬離子束輻照改性10min后的培養(yǎng)皿中，寬離子束輻照的能量為15keV，劑量為15kGy；細(xì)胞與水樣富集物孵育后，Hank’s緩沖液清洗3次，0.25%胰蛋白酶-EDTA酶解2分鐘并吹打成單個(gè)細(xì)胞，懸浮于F12完全培養(yǎng)液中，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，稀釋，重新種植300個(gè)細(xì)胞于經(jīng)過寬離子束輻照改性后的培養(yǎng)皿中；

b、將培養(yǎng)皿在37℃，體積濃度為5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8天形成細(xì)胞克隆，出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)，終止培養(yǎng)；

（4）毒性量化

c、對(duì)培養(yǎng)皿中的細(xì)胞克隆用PBS緩沖液清洗2次，使用固定液固定20分鐘，固定液為甲醇:乙酸按體積比9:1混合而成，用移液器吸去固定液，然后使用亞甲基藍(lán)染液對(duì)細(xì)胞克隆染色，染色12小時(shí)，流水洗除染液后，空氣干燥，每次染色前對(duì)亞甲基藍(lán)染液超聲處理30分鐘；

d、計(jì)數(shù)培養(yǎng)皿中細(xì)胞克隆的個(gè)數(shù)，肉眼直接記數(shù)克隆數(shù)（每個(gè)克隆包含細(xì)胞數(shù)應(yīng)大于50），使用下面公式對(duì)水樣的毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)：

細(xì)胞種植率%=培養(yǎng)皿中的細(xì)胞克隆數(shù)/所種植的細(xì)胞數(shù)×100%；

細(xì)胞存活率%=處理組細(xì)胞種植率%/對(duì)照細(xì)胞種植率%×100%。

圖2顯示了采集于2009年9月的五個(gè)水樣作用AL細(xì)胞后，對(duì)AL細(xì)胞克隆形成能力的影響。圖中SM-1是河水，SM-2是距河1公里的井水，SN-1、SN-2和SN-3分別是距河20公里的井水。從圖中可以看出，在豐水期時(shí)，50ml/ml劑量組的SM-1和SM-2水樣富集物處理AL細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞的存活率分別顯著下降到10.67±0.74%（p<0.01，圖2A）和20.55±6.09%（p<0.01，圖2B），下降約90%和80%，處理8天后，細(xì)胞的存活率都為0；10ml/ml劑量組的SM-1和SM-2水樣富集物處理AL細(xì)胞8天后，細(xì)胞的存活率分別顯著下降到31.06±2.58%（p<0.01，圖2A）和21.84±9.44%（p<0.01，圖2B），下降約69%和79%，處理16天后，細(xì)胞的存活率都為0。而SN-1和SN-3水樣富集物處理AL細(xì)胞16天后，對(duì)細(xì)胞的克隆存活均無(wú)明顯影響（圖2C和圖2E）；10ml/ml劑量組的SN-2水樣富集物處理AL細(xì)胞16天后，對(duì)細(xì)胞的克隆存活也無(wú)明顯影響（圖2D）。由此我們得出，SM-1和SM-2水樣富集物的細(xì)胞毒性相當(dāng)，它們較之SN-1、SN-2和SN-3水樣富集物的細(xì)胞毒性更大。

實(shí)施例2

檢測(cè)賈魯河枯水期水樣富集物對(duì)細(xì)胞存活率的影響。

方法和實(shí)施例1相同。為了比較豐水期和枯水期之間水樣富集物的細(xì)胞毒性，對(duì)采集于2010年3月的五個(gè)水樣同樣進(jìn)行細(xì)胞克隆形成能力研究。圖3顯示，在枯水期時(shí)，對(duì)于50ml/ml劑量組的水樣富集物，SM-1水樣富集物處理AL細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞的存活率為0（圖3A）；SM-2水樣富集物處理AL細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞的存活率顯著下降到19.74±10.49%（p<0.01，圖3B），下降約80%。然而，同樣是50ml/ml劑量組的水樣富集物，SN-2水樣富集物處理AL細(xì)胞24小時(shí)后，對(duì)細(xì)胞的克隆存活無(wú)明顯影響（圖3D）；SN-1和SN-3水樣富集物處理AL細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞的存活率也只是顯著下降到35.67±15.76%（p<0.05，圖3C）和27.63±10.22%（p<0.01，圖3E），下降約65%和73%。由此可以得出結(jié)論，SM-1水樣富集物的細(xì)胞毒性最高，其次是SM-2水樣富集物，SN-1、SN-2和SN-3水樣富集物的細(xì)胞毒性則比SM-1和SM-2水樣富集物的細(xì)胞毒性小。

從實(shí)施例1和例2可以看出，水樣富集物處理AL細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞的克隆形成能力就有顯著性的降低，因此優(yōu)選的細(xì)胞染毒時(shí)間范圍為4小時(shí)～24小時(shí)。