技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬分子免疫領(lǐng)域，涉及一種乙肝病毒核心抗原的核酸適配體的序列及其用途。

背景技術(shù)：

乙型肝炎(乙肝)是嚴重危害我國人民健康的主要傳染病，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，我國乙型肝炎病毒(乙肝病毒，HBV)攜帶者達1.3億，肝病患者高達3000萬，每年因各類肝病死亡人數(shù)達30萬。肝病已經(jīng)成為當今威脅中國人口健康的主要疾病之一，數(shù)量巨大的慢性肝病患者的存在，以及每年新發(fā)現(xiàn)肝炎病例的出現(xiàn)，對社會醫(yī)療資源造成極大的消耗。研究顯示，乙肝病毒是乙型肝炎的主要致病原，病原明確。目前乙肝的治療效果并不是很理想，臨床實踐顯示乙肝病毒已對大部分治療藥物產(chǎn)生了耐藥性，因此，亟待開發(fā)新的對抗乙肝病毒的治療手段。

現(xiàn)有技術(shù)公開了乙肝病毒的DNA序列，其主要含有四個編碼區(qū)，分別為S、P、C、X開放讀框；其中，C開放讀框編碼核心抗原(HBcAg)，該核心抗原是診斷乙肝病毒感染的重要標志之一。有研究指出，對乙肝病毒自身生活周期密切相關(guān)的蛋白或酶進行干預(yù)是殺滅和抑制病毒的有效策略之一，也是未來診斷和治療乙肝的理想方向。

目前，已知核酸適配體(aptamer)是經(jīng)體外篩選技術(shù)篩選出的能特異結(jié)合金屬離子、多肽、蛋白質(zhì)乃至整個細胞的寡聚核苷酸(DNA或RNA)片段，其特異性如同抗體一樣，對可結(jié)合的配體有嚴格的識別能力和高度的親和力。核酸適配體的體外篩選技術(shù)被稱為指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化(Systematicevolutionofligandbyexponentialenrichment，SELEX)技術(shù)，SELEX技術(shù)模擬自然進化過程，對隨機寡核苷酸文庫施加選擇壓力(結(jié)合靶目標)，淘選與靶目標高度特異結(jié)合片段(如圖1所示)；相比抗體等多肽類的適配體(peptideaptamer)，核酸適配體的優(yōu)勢相當明顯，例如：制備簡單快捷、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、至今未見報道存在免疫原性或毒性、靶分子范圍廣、親和力高、特異性強、易于進行改造修飾等。

核酸適配體的諸多優(yōu)勢令其在基礎(chǔ)研究、臨床檢測、新藥開發(fā)等方面有著廣泛的用途。在臨床檢測方面，目前能用抗原抗體反應(yīng)進行檢測的技術(shù)幾乎都可以用核酸適配體替代，如Archemix公司開發(fā)的一種適配體分子傳感器——RiboReporterTM即可以將檢測到的蛋白信號直接轉(zhuǎn)化成光信號記錄并分析，從而實現(xiàn)了對生物混合液(如血清、細胞提取物)中的大分子蛋白的直接快速檢測。在新藥開發(fā)方面，最典型的例子便是第一個通過美國FDA批準上市的核酸適配體藥物Macugen。它是抗血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)的核酸適配體，被用于治療濕性老年性黃斑變性(wetAMD)。另一個核酸適配體藥物的例子是由Aptamera公司研制的AGR0100。臨床前試驗表明，AGRO100對多種癌細胞均有抑制作用。

目前國內(nèi)外大部分從事核酸適配體研究的科學(xué)家和生物技術(shù)公司主要針對心血管疾病，而較少關(guān)注中國人的常見疾病，如肝炎、肝癌、胃癌等，因此本發(fā)明擬考慮核酸適配體如何應(yīng)用于上述嚴重威脅我國人民健康的重大疾病。就乙肝病毒來說，已有研究報道了針對乙肝病毒核心抗原的肽適配體，但迄今尚無針對乙肝病毒的核酸適配體的報道或公開。因此，開發(fā)針對乙肝病毒的核酸適配體，將為乙肝病毒的診斷和抗乙肝病毒治療提供有力支持，具有重要的臨床價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種乙肝病毒核心抗原的核酸適配體的序列，具體涉及一種HBV核心抗原的核酸適配體中具有特異結(jié)合HBV核心抗原的序列(本發(fā)明中命名為HBcAp3)。

本發(fā)明中，所述的HBV核心抗原的核酸適配體(序列1)中含有特異結(jié)合HBV核心抗原的特征序列，所述的特征序列為TATTT。

本發(fā)明中，所述的乙肝病毒核心抗原選自乙肝病毒株A、B、C、D、E、F、G、F、G或H基因型。

本發(fā)明的進一步目的是提供所述核酸適配體序列的用途，根據(jù)對該序列分析，設(shè)計抗HBV感染的藥物并進一步制備抗HBV感染的藥物或制品。

本發(fā)明用基因重組質(zhì)粒表達核心抗原，并篩選與其特異結(jié)合的核酸適配體，制得具有特異結(jié)合HBV核心抗原的特征序列TATTT(本發(fā)明中命名為HBcAp3)。

本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

采用已知的分子克隆技術(shù)，以含有雙拷貝HBV基因組序列的重組質(zhì)粒pBS_HBV3.6II(序列2)為基礎(chǔ)，根據(jù)HBc基因序列設(shè)計引物：

HBc_L：5’-GCCCATATGGACATTGACCCGTA-3’

HBc_R：5’-GCCCTCGAGTCAAACAACAGTAGTTT-3’

通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增出HBc基因，用限制性內(nèi)切酶NdeI和NotI酶切，同時用相同的限制性內(nèi)切酶切pET28a質(zhì)粒(購自北京畢特博生物公司)，然后用T4連接酶連接入pET28a的NdeI/NotI酶切位點中，獲得含HBc基因的重組質(zhì)粒pET28a-HBc(質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖2所示)；

將含有pET28a-HBc的大腸桿菌BL21(DE3)(購自上海杰慶生物公司)單菌落接種到含卡納抗生素的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至20OmL新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達后離心收集菌體；

用5mL裂解液(50mMTris-HCl(pH8.5～9.0)，2mMEDTA，100mMNaCl，0.5％TritonX-100，1mg/ml溶菌酶)重懸細菌，冰浴中100w超聲破碎；取1ml上清與500ulNi-NTAAgarose珠子混合，用2mlPBS+Mg(1mMMgCl2)洗兩遍，再用2mlPBS+Mg重懸，吸出蛋白-珠子混合物；加RochecOmpleteMiniEDTA-free蛋白保護劑保存。

隨后利用核酸適配體的體外篩選技術(shù)即SELEX技術(shù)，以HBc蛋白-珠子混合物為正篩靶標，以含pET28a空白質(zhì)粒的大腸桿菌表達產(chǎn)物-珠子混合物為反篩靶標，從體外合成的隨機寡聚DNA文庫(5’-acgctcggatgccactacagNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNctcatggacgtgctggtgac-3’)中篩選出與HBc特異結(jié)合的核酸適配體。將篩選出的序列用引物Aptamer_L(5’-FAM-acgctcggatgccactacag-3’)和Aptamer_R(5’-biotin-gtcaccagcacgtccatgag-3’)進行擴增并進行TA克隆入pMD19-T載體(購自上海博光生物公司)，轉(zhuǎn)化DH5a細菌(購自北京天根生物公司)。挑去白色菌落以引物RV-M(5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)和M13(-47)(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)進行PCR確定陽性克隆后，抽提質(zhì)粒并用M13(-47)(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)為測序引物進行測序反應(yīng)，上測序儀測序；根據(jù)測序結(jié)果分析特征序列。

本發(fā)明中，所述的核酸適配體序列選自天然存在或人工合成的序列，或任何其他來源的同樣的序列；

所述的核酸適配體序列含有與所述特征序列的核苷酸的全部相同的序列，即所有核酸適配體均含有所述的特征序列。

本發(fā)明所述的特征序列是核酸適配體與HBc特異性結(jié)合的基礎(chǔ)，可用于藥物設(shè)計、制備藥物或其他制品，所述的含有該特征序列的核酸適配體可作為抗HBV的探針或靶點，用于設(shè)計、制備抗乙肝病毒的藥物或制劑。

附圖說明

圖1是核酸適配體的體外篩選技術(shù)即SELEX技術(shù)的一般流程圖。

圖2是pET28a-HBc質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖.

具體實施方式

實施例1：HBc基因克隆

用已知的分子克隆技術(shù)，以含有雙拷貝HBV基因組序列的重組質(zhì)粒pBS_HBV3.6II為基礎(chǔ)，根據(jù)HBc基因序列設(shè)計引物：

HBc_L：5’-GCCCATATGGACATTGACCCGTA-3’

HBc_R：5’-GCCCTCGAGTCAAACAACAGTAGTTT-3’

配置PCR體系(總體積50ul)：H2O38ul，10×PCR緩沖液5ul，25mMMgCl23ul，dNTP(10mM)lul，引物混合物1.5ul(H2O∶100uMHBc_L∶100uMHBc_R＝4∶0.5∶0.5)，DNA模板1ul，PrimeStar酶0.5ul。按如下條件，在PCR儀上擴增：94℃加熱預(yù)變性2min后，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，30個循環(huán)，72℃延伸8min，4℃保溫＜1h。

反應(yīng)結(jié)束后，取5ul產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠中100V恒壓電泳，鑒定擴增出與預(yù)期大小相符的DNA片段后，用Axygen的PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒進行PCR產(chǎn)物純化。

用限制性內(nèi)切酶NdeI和NotI雙酶切，同時用相同的限制性內(nèi)切酶切pET28a質(zhì)粒，在1％的瓊脂糖凝膠中100V恒壓電泳后用Axygen膠回收試劑盒回收酶切片段，在T4連接酶作用下連接上述兩段片段，獲得含HBc基因的重組質(zhì)粒pET28a-HBc。將pET28a-HBc和pET28a空白質(zhì)粒分別用天根的高效轉(zhuǎn)化試劑盒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)細胞中。

實施例2：HBc表達與純化

將含有重組表達質(zhì)粒pET28a-HBc的大腸桿菌單菌落接種到5mL含Kan抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。按1∶100體積比將過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至20OmL新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2～4h，待OD600值達0.6時，加入IPTG(終濃度為O.1mM)，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)8h。4000rpm離心30min收集菌體。

用5mL裂解液(50mMTris-HCl(pH8.5～9.0)，2mMEDTA，100mMNaCl，0.5％TritonX-100，1mg/ml溶菌酶)重懸細菌，分裝在3個2ml的管中，-80度30min。冰浴中100w超聲破碎(2s～5s，60～80次)。取1ml上清與500ulNi-NTAAgarose珠子混勻，加入純化柱，用2mlPBS+Mg(1mMMgCl2)洗兩遍后，用2mlPBS+Mg重懸吸出蛋白珠子混合物。每管加7×RochecOmpleteMiniEDTA-free蛋白保護劑，4度保存作為正篩靶標。

同樣將含pET28a空白質(zhì)粒的大腸桿菌進行相同操作得到反篩靶標。

實施例3：核酸適配體篩選(一輪)

首輪寡聚DNA文庫序列：

5’-acgctcggatgccactacagNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNctcatggacgtgctggtgac-3’

富集所用引物：

Aptamer_L：5’-FAM-acgctcggatgccactacag-3’

Aptamer_R：5’-biotin-gtcaccagcacgtccatgag-3’

將寡聚DNA文庫測定OD260后，離心干燥。用300ulPBS+Mg溶解文庫，取200pmol(第一輪2.5nmol)，95℃8min，迅速置冰上，稍后快速離心。

反篩：將200pmol的文庫吸入相當于40pmol正篩靶標的反篩靶標中，用PBS+Mg補足到800ul。37℃搖床振蕩30min。吸入Milipore超濾管快速離心(＜1000rpm)，取濾出液。

正篩：取40pmol正篩靶標，800rpm離心，吸掉上清，然后用1mlPBS+Mg洗兩次。將濾出液加入40pmol正篩靶標中，37℃搖床振蕩30min。吸入Milipore超濾管快速離心(＜1000rpm)，棄濾出液。用PBS+Mg超濾洗滌三遍。隨后用600uLPBS+Mg將正篩靶標從膜上吸到另一管中，加60uL胰酶，37℃10min。加水補足到1mL，95℃10min，迅速置冰上。待變冷后，5000rpm離心5min。上清轉(zhuǎn)移到一干凈的EP管中。

富集：配置PCR體系(總體積1000ul)：H2O740ul，10×PCR緩沖液100ul，dNTP80ul，引物混合物25ul(H2O∶100uMAptamer_L∶100uMAptamer_R＝4∶0.5∶0.5)，DNA模板(正篩上清50ul，TaqHS酶5ul。

按如下條件，在PCR儀上擴增：94℃加熱預(yù)變性2min后，94℃變性30s，58℃退火20s，72℃延伸20s，20個循環(huán)，72℃延伸4min，4℃保溫＜1h。

純化：純化柱用MilliQ水洗一遍，PBS洗兩遍，加入150ulGE的StreptavidinSepharose后PBS洗兩遍，加入PCR產(chǎn)物，搖床振蕩20min，放出液體，PBS洗兩遍后，加0.5mLNaOH靜置2-3min后放出液體，放出液上脫鹽柱，待液體從脫鹽柱幾乎流盡時加1mLMilliQ水洗脫，同時開始接洗脫液1mL，該洗脫液即為富集了的寡聚DNA文庫，可進行下一輪篩選。

實施例4：核酸適配體TA克隆

在微量離心管中配制下列溶液，全量為5ul：pMD19-TVector1ul，適配體PCR產(chǎn)物1ul，dH2O3ul。加入5ul的SolutionI。16℃反應(yīng)30分鐘。全量(10ul)加入至100ulDH5a感受態(tài)細胞中，冰中放置30分鐘。42℃加熱45秒鐘后，再在冰中放置1分鐘。加入890ulLB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)60分鐘。在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落。

實施例5：核酸適配體克隆的菌落PCR與測序

pMD19-T菌落PCR和測序引物：

RV-M：5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′

M13(-47)：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′

用滅菌牙簽挑取白色單克隆菌落加入到4mlLB(Amp50ng/L)液體培養(yǎng)基內(nèi)，180rpm，37℃搖菌過夜(＜16h).取1ul菌液作PCR模板，進行PCR擴增。以水作為陰性對照。

配置PCR體系：菌液1ul，引物RV-M(10uM)0.5ul，引物M13(-47)0.5ul，2×TaqMix7.5ul，水5.5ul(總體系15ul)。按如下條件，在PCR儀上擴增：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共33個循環(huán)；72℃總延伸10min。

反應(yīng)結(jié)束后取3-6ul菌液PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，140V電泳20min。若出現(xiàn)明亮的目的大小條帶而陰性對照沒有條帶，說明該菌液為陽性克隆。

隨后行質(zhì)粒提?。喝?ml過夜培養(yǎng)的新鮮菌液，收集菌體，按照Omega的質(zhì)粒提取試劑盒操作說明進行質(zhì)粒提取。最后加水溶解。采用Nanodrop對提取的質(zhì)粒進行濃度和純度測定。

測序反應(yīng)：BDTv3.10.5ul，質(zhì)粒100ng，引物M13(-47)0.5ul，加水至5ul。96℃加熱預(yù)變性1min后，96℃變性10s，50℃退火10s，60℃延伸4min，33個循環(huán)，4℃保溫。反應(yīng)結(jié)束后將5ul測序產(chǎn)物+1.25ulEDTA(125mM，pH8.0)+15ul無水乙醇封好，震蕩4次，室溫放置15min，立即3860rpm，室溫(25℃)離心40min后立即倒扣在紙巾上，離心到900rpm，立刻停。加60ul70％乙醇，(不需震蕩)封好。隨后室溫下3860rpm，離心15min。立即倒扣在紙巾上，離心到900rpm，立刻停。避光室溫干燥15min，加10ulHi-Di，封好蓋。95℃變性4min，立刻冰上靜置4min，短暫離心，上3730xl測序儀。測序結(jié)果顯示，12個克隆中都存在同一段序列TATTT。結(jié)果證實，本發(fā)明獲得了具有特異結(jié)合HBV核心抗原的特征序列，該段特征序列為TATTT。